基于微卫星分子标记信息对低温条件下凡纳滨对虾生长及出肉率性状的遗传参数估计

发布时间：2020-07-16 08:24

【摘要】：凡纳滨对虾(Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei),又名南美白对虾,自然分布于南美洲太平洋沿岸水域,是世界重要的对虾类养殖品种之一。凡纳滨对虾具有适应性广泛、对不良环境抗逆性强、生长速度快等特点,其肉质鲜美,深受人们的喜爱,有着十分广阔的市场前景。但是近年来由于气候异常,导致我国南方凡纳滨对虾主养殖区屡次遭遇寒灾,对凡纳滨对虾产业造成重大损失。异常低温不仅导致凡纳滨对虾大量死亡,同时温度因素也制约着凡纳滨对虾的养殖季节和地域,影响养殖产量和效益。为了加速培育出耐低温凡纳滨对虾新品种,提高养殖产量和经济效益,对凡纳滨对虾耐低温相关性状的遗传参数进行估计是十分必要的。然而,在传统的BLUP遗传育种方法中,个体间亲缘关系的确定来源于人为记录的物理系谱,物理系谱的构建很容易由于标记脱落、误读和引入共同环境效应而导致信息错误或不准确,给性状遗传参数的准确估计造成困难。本研究首次将微卫星分子标记引入凡纳滨对虾耐低温性状遗传参数的评估中,通过计算分子亲缘相关度构建分子系谱进而对性状遗传参数进行估计,并利用交叉验证跟物理系谱相比较,以佐证分子亲缘相关度在实际中估计性状遗传参数的可行性。本实验主要结果如下:(1)本实验通过筛选凡纳滨对虾多态性微卫星位点,并不断优化位点组合、反应体系及反应程序,成功建立了一个五重、两个四重和一个三重PCR反应体系,并将其应用于11个凡纳滨对虾家系的亲权鉴定。结果显示,4组多重PCR体系中的16个微卫星位点在11个凡纳滨对虾家系中的平均等位基因数(Na)为6,平均多态信息含量(PIC)为0.581,平均观测杂合度(Ho)为0.513,平均期望杂合度(He)为0.636。利用Cervus3.0软件,对已知系谱关系的11个凡纳滨对虾家系进行亲权分析,其第一亲本累积排除率(CE-1P)、第二亲本累积排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)分别为 0.99525487、0.99990862 和 0.99999986。进一步分析表明,当同时使用4组多重PCR体系进行亲权分析时,其模拟配对率和亲权鉴定准确率均为100%,全同胞和半同胞家系鉴别效果良好,体现出4组多重PCR体系具有良好的鉴别能力。(2)本实验采用已经建立的4组多重PCR体系对凡纳滨对虾家系进行基因分型,通过Coancestry 1.0.1.2软件中TrioML参数计算个体间分子亲缘相关度,进而构建分子系谱,并分别利用物理系谱和分子系谱对低温条件下凡纳滨对虾生长及出肉率性状进行遗传参数估计。结果显示,个体间分子亲缘相关度均在0～1之间,平均值为0.058,分子亲缘相关度与物理亲缘相关度间皮尔逊相关系数为0.574,为中等强度正相关,表现出分子亲缘相关度构建的分子系谱有较高的可信度。利用物理系谱估算出的体重(BW)、体长(BL)、肉重(MW)和出肉率(MR)性状的遗传力分别为 0.16±0.05、0.12±0.04、0.20±0.05 和 0.18±0.05,根据分子系谱估算上述性状的遗传力分别为0.07±0.03(BW)、0.04±0.02(BL)、0.10±0.03(MW)、0.10±0.03(MR),两者皆为低水平遗传力。在物理系谱信息下,计算得到低温条件下凡纳滨对虾出肉率性状与可测量性状之间的遗传相关,结果显示出肉率(MR)与腹节全长(ASL)的遗传相关系数为最大(0.636±0.133),低温条件下凡纳滨对虾群体平均出肉率为51.37%。交叉验证的结果表明,利用物理系谱和分子系谱计算的育种值预测值与观察值间皮尔逊相关系数分别为0.56和0.55,两者较为接近,说明利用分子系谱和物理系谱预测育种值的准确度相似总体来看,微卫星分子标记应用在水产动物性状遗传参数估计中是具有巨大潜力的。本研究所得数据为制定科学有效的育种方案提供了参考,对进一步研究凡纳滨对虾耐低温选育有积极的借鉴意义。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【图文】：

基因组,引物

图２－１凡纳滨对虾基因组ＤＮＡ逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｇｅｎｏｍｅｓ邋ＤＮＡ邋ｏｆ邋Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ邋ｖａｎｎａｍｅｉ逡逑．邋４．邋３凡纳滨对虾微卫星引物的筛选及多重ＰＣＲ体系的优化逡逑本实验引用邋Ｍｅｅｈａｎ邋ｅｆ邋ａ／［１４４］、Ｚｈａｎｇ邋ｅｆ邋ａ／［１４５］、Ａ丨ｅｉｖａｒ－Ｗａｒｒｅｎ邋ｅｆ邋ａ／［５７］、Ｄｅｎｉｓｅ逡逑．ＧＡＲＣ丨Ａｄｆｌ／［１４６］和于洋等［１４７］文章中公布的微卫星数据，通过用非变性聚丙烯逡逑酰氨凝胶电泳（ＰＡＧＥ）来筛选在实验群体中显多态性的微卫星位点。根据每个逡逑卫星位点扩增片段长度的差异性和退火温度进行多重ＰＣＲ位点组合，同时利逡逑ＭＰＥｐｒｉｍｅｒｓ软件１｜４８，１４９］检测筛选好的多重ＰＣＲ组合反应体系中的引物是否会逡逑生错配、引物二聚体和发卡结构，去除或替换影响整个体系稳定性的引物对。逡逑过优化多重ＰＣＲ反应体系中各引物浓度、退火温度、循环次数、以及反应体逡逑中各组分的浓度来达到多重ＰＣＲ体系的最佳扩增效果。逡逑．邋４邋４荧光标记修饰及基因分型逡逑本实验采用四种不同的荧光标记来修饰引物，分别是６－ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、逡逑ＡＭＲＡ，保持每个多重ＰＣＲ组合中扩增片段大小相邻的位点引物修饰的荧光种逡逑类不同。用ＡＢＩ邋３１３０ｘ１测序仪对ＰＣＲ产物进行基因分型，具体步骤为：①将ＰＣＲ逡逑

分型,基因分型,微卫星,家系

逦第二章凡纳滨对虾微卫星多重ＰＣＲ体系的建立及其在家系亲权鉴定中的应用逦逡逑三重邋ＰＣＲ逦ＤＮＡ邋模板（５０ｎｇ／ｎｌ）逦２＾ｉｌ逦９４°Ｃ邋５ｍｉｎ逡逑ｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋３邋ｌｏｃｉ逦ｌＯ＾Ｔａｑ邋Ｂｕｆｆｅｒ逦２．５（ｉｌ逦９４邋Ｃ邋４０ｓ逦、逡逑Ｍｇ＾（２５ｍＭｅａｃｈ）逦２．５＾１逦６２＂Ｃ（每循环降邋０．５。0邋ｌｍｉｎ邋＾０ｒ逡逑７２邋°Ｃ邋ｌｍｉｎ逡逑ｄＮＴＰ（２ｍＭ邋ｅａｃｈ）逦２．５ｕｌ逦＾逡逑９４邋°Ｃ逦４０ｓ逦＂逡逑Ｐｒｉｍｅｒ（ｌＯｕＭｅａｃｈ）邋ＴＵＭＸＬｖ８．２５６逦０．２ｕｌ逡逑５８邋Ｃ邋１邋ｍｉｎ逦ｙ邋１５ｒ逡逑ＴＵＭＸＬｖ８．２２０逦０．２５＾１逦７２°Ｃ逦ｌｍｉｎ逡逑ＴＵＭＸＬｖ７．５６逦０．３＾１逦９４邋＂Ｃ逦４０ｓ逦＂逡逑}0酶（２．５Ｕ／ｆｉｌ）逦０．３＾１逦５５＃Ｃ邋ｌｍｉｎ逦＞邋１５ｒ逡逑ｄｄＨ２０逦１３．７＾１逦７２°Ｃ逦ｌｍｉｎ逦＞逡逑７２邋°Ｃ逦５ｍｉｎ逡逑４0Ｃ邋Ｈｏｌｄ逡逑基因分型结果显示，４组凡纳滨对虾微卫星多重ＰＣＲ反应体系均可以获得逡逑较好的扩增效果。其中，五重ＰＣＲ、四重ＰＣＲ１和四重ＰＣＲ２的基因分型峰值图逡逑分别见图２－２、图２－３和图２－４。１１个凡纳滨对虾家系在１６个微卫星位点上的基逡逑因型信息见附表１。逡逑８０逦１６０逦２４０逦３２０逦４００逦４８０逡逑２４０００＋逦＊逦１逦＂Ｉ逦逦邋逦逦逦逦逦逦逦逦逦逡逑

亲权鉴定,准确率,微卫星,亲权

］逡逑在亲本总数为２０个，置信度为９５％的情况下，实验验证了邋４组微卫星多重逡逑ＰＣＲ体系亲权鉴定的准确率。如图２－５所示，随着不断累加多重ＰＣＲ体系，其逡逑亲权鉴定准确率逐渐提高，当同时使用４组多重ＰＣＲ体系进行亲权分析时，无逡逑论亲本性别是否已知，其亲权鉴定准确率均为１００％。半同胞和全同胞家系均鉴逡逑别效果良好，验证结果与模拟结果基本吻合，说明亲权分析的结果具有较高的准逡逑确度和可信度。逡逑２６逡逑

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