鳜传染性脾肾坏死病毒敏感细胞系的建立及病毒增殖依赖于谷氨酰胺的机制研究

发布时间：2020-08-01 15:35

【摘要】：鳜鱼是我国主要的名特优养殖鱼类之一,自1994年传染性脾肾坏死病毒病(infectious spleen and kidney necrosis virus disease,ISKNVD)暴发以来,给我国鳜鱼养殖业带来严重危害。因此,对其开展深入研究非常必要。长期以来,受制于ISKNV敏感细胞系的缺乏,ISKNV致病机制等一直难以深入开展,敏感细胞系的建立已成为研究该病的技术瓶颈。本研究针对上述问题,首先开展了ISKNV敏感细胞系的建立工作,建立了定量PCR快速检测病毒含量技术、制备了识别病毒MCP的单克隆抗体,在此基础上,深入开展了ISKNV增殖复制与谷氨酰胺的关系。取得的结果如下:(1)鳜脑组织细胞系的建立针对鳜鱼脑组织细胞的特征,采用胶原酶消化法分离脑组织细胞,进行原代培养,继而成功构建了鳜鱼脑组织细胞系,命名为CPB(Chinese perch cell line)。目前该细胞系已传了140多代,形态以成纤维样细胞为主。CPB最适培养基为含10%血清的L15培养基,外源基因可以在CPB胞内表达。病毒感染实验显示,CPB对ISKNV高度敏感,不同代次细胞对病毒的感染滴度为6.58 6.62 log TCID50 ml-1;通过RT-PCR、免疫印迹、透射电镜进一步证实ISKNV可以感染CPB,在感染细胞内观察到大量的病毒粒子。鱼体回归感染实验显示,病毒感染细胞上清对健康鳜鱼高度致死,且随着温度的升高发病速度越快。(2)基于荧光定量PCR的ISKNV含量快速检测方法研究利用基因重组技术成功将ISKNV的ORF007基因克隆至真核表达质粒pcDNA3.1+质粒中,命名为pcDNA007。然后针对ISKNV的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数,结果显示荧光定量PCR测定的病毒拷贝数与CPE法测定的病毒滴度具有良好的线性关系,其线性方程为y=1.076x+0.545(R2=0.9986),其中y为基因组拷贝数浓度的对数,x为病毒滴度TCID50的对数。表明荧光定量PCR法可替代CPE法应用于病毒定量。(3)ISKNV主衣壳蛋白的单克隆抗体的制备及鉴定将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为IgG1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白。(4)ISKNV增殖复制依赖于谷氨酰胺(Gln)的机制研究实验室前期研究发现Gln是ISKNV复制增殖所必需的,Gln可以通过TCA循环回补代谢中间产物部分拯救病毒增殖。本章在实验室前期研究的基础上,继续对能完全拯救病毒增殖的TCA代谢中间产物进行筛选,并对Gln是否还为病毒增殖提供能量ATP以及GSH进行探讨。结果显示,当添加谷氨酸脱氢酶抑制剂EGCG和谷胱甘肽合成途径抑制剂BSO后,ISKNV的增殖复制被明显抑制,病毒产量显著下降;当回补三羧酸循环(TCA)中间代谢产物、ATP以及还原性谷胱甘肽(GSHe)后,ISKNV的增殖被明显拯救,其中柠檬酸拯救病毒增殖效果最好,ATP主要是促进病毒释放,而只有低剂量的GSHe对病毒增殖有促进作用。上述结果说明Gln可以通过谷氨酰胺酵解途径为病毒增殖提供生物大分子和能量ATP,通过合成GSH为病毒增殖提供适量的氧化还原条件。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943
【图文】：

细胞的,细胞,染色体,核型分析

(A) (B)图 2-1 不同代次 CPB 细胞形态特征。（A）第 15 代细胞；（B）第 66 代细胞。Fig. 2-1 Morphology of CPB cells. (A) Morphology of CPB cells at passage 15; (B)passage 66 (right).2.2.2 核型分析CPB 细胞在第 5 代和第 62 代分别做了核型分析，结果显示在第 5 代时 93%的细胞含有 48 个染色体（图 2-2A），第 62 代细胞的染色体数量在 28-56 中都有分布，其中细胞染色体重数为 36、48 和 56（图 2-2B）。从图 2-2C 可以发现，有小部分细胞的染色体呈现非整倍体的、不对称的分布，所有细胞与体外细胞染色体形态相似，都是端着丝点染色体。

细胞形态,细胞,重数,染色体形态

(B)图 2-1 不同代次 CPB 细胞形态特征。（A）第 15 代细胞；（B）第 66 代细胞Fig. 2-1 Morphology of CPB cells. (A) Morphology of CPB cells at passage 15; (Bpassage 66 (right).型分析B 细胞在第 5 代和第 62 代分别做了核型分析，结果显示在第 5 代时 93 个染色体（图 2-2A），第 62 代细胞的染色体数量在 28-56 中都有分布重数为 36、48 和 56（图 2-2B）。从图 2-2C 可以发现，有小部分细胞倍体的、不对称的分布，所有细胞与体外细胞染色体形态相似，都是

细胞生长曲线,细胞,培养基,最适培养条件

胞最适培养条件不同的培养基、不同浓度 FBS 培养 CPB 细胞，绘制细胞生长曲线。从图细胞生长曲线近似抛物线，其中 L-15 培养基培养至 4 天时，细胞量最高/毫升，因此 L15 为最佳培养基。 2-3(B)中可看出，分别添加 10%、8%、6%和 4%血清的试验组，细胞均量然后开始数量减少，细胞处于衰退期。添加 2%血清的试验组细胞增浓度组细胞增殖速度最快，细胞数量最高，因此，10%血清含量最适合

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