杀大菱鲆病原性盾纤毛虫海洋菌株YCSC6的鉴定及其基因组、转录组和代谢组分析

发布时间：2020-08-25 19:46

【摘要】：大菱鲆(Scophthalmus maximus)人工养殖是我国海水养殖的重要支柱产业之一。然而,随着其规模的迅猛发展,各种养殖疾病接踵而至,由盾纤毛虫等引起的寄生虫病是其中危害严重的疾病之一。为防治盾纤毛虫病,开发新型的生物杀虫剂具有十分广阔的应用前景。海洋微生物可产生结构独特、活性多样且不同于陆地来源的代谢产物,其中某些代谢产物可作为杀虫制剂。本研究从近海微生物菌种资源库中筛选获得了一株有杀盾纤毛虫效果的细菌,并对其开展了杀虫能力、遗传背景的研究,主要研究成果如下:1.对采自莱州大菱鲆养殖场的11条典型病鱼进行了病理学观察。组织切片显示,病鱼皮肤、鳍、鳃、肝脏、肠及脑中均检出病原性纤毛虫。对分离自病鱼脑部的纤毛虫进行形态及分子鉴定,确定其为海洋尾丝虫(Uronema marinum)。感染实验证实海洋尾丝虫可感染大菱鲆,并引起大菱鲆盾纤毛虫病。2.对筛选获得的有杀盾纤毛虫效果的细菌进行鉴定,利用形态学和分子生物学方法鉴定该菌为肋生盐弧菌(Salinivibrio costicola subsp.)。通过共培养实验进行YCSC6杀灭大菱鲆病原性盾纤毛虫的药效活性实验,同时利用光学显微镜和扫描电镜观察记录YCSC6的杀虫特征。结果发现海洋细菌YCSC6发酵上清液可导致盾纤毛虫膜出现穿孔,膜完整性丧失从而裂解。在一定时间范围内,发酵液发酵时间越长,裂解能力则越强。3.为了进一步研究海洋细菌YCSC6的杀虫机制和次生代谢产物生物合成基因簇,我们对该菌株进行了全基因组测序,通过基因组组装、基因预测、功能注释以及总次生代谢物生物合成基因簇预测,为后期转录组及代谢组分析奠定了基础。结果显示,YCSC6全基因组大小为3.87Mb,共预测得到3896个基因。该基因组含两个环形染色体,长序列(scf7180000000004)为基因组序列,平均GC含量为50.03%,短序列(scf7180000000005)为质粒,平均GC含量为48.80%,预测到21个次生代谢产物生物合成基因簇,相关功能基因18个,主要分为三大类:膜绑定溶胞壁质转糖酶,他体细胞溶解,磷脂酶活性。该基因组GenBank注册号为NHNL00000000,本文所介绍版本为NHNL01000000。4.在得到海洋细菌YCSC6全基因组的基础上,本研究对不同培养时间的海洋细菌YCSC6转录组及代谢组进行了分析,通过不同组间转录组和代谢组的比较,预测到大量差异表达基因及差异代谢物。代谢组鉴定到的物质数目为1129,无法定性的物质数目为16814。经比对,筛选出84种具有功能描述的显著上调差异代谢物,后期可通过实验验证这些物质的杀虫及膜裂解活性。样品表达模式分析显示,在转录组和代谢组中分别有一组模块表达模式与目的产物的作用模式效果重合,均在48h后逐渐高表达,目的产物可能存在于其中。后期将重点分析差异基因及差异代谢物,以期找到杀虫基因及其代谢通路,为杀大菱鲆病原性盾纤毛虫开发安全、高效的药剂。
【学位授予单位】：国家海洋局第一海洋研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943
【图文】：

纤毛虫病,大菱鲆,纤毛虫

-1. 大菱鲆2-1. Symptbody surfafected tissu2 病鱼组组织切片结构松散皮肤组织变化明显。随着纤毛织切片显鲆盾纤毛虫病C）感toms of infeace. B) Exopues (Arrows组织病理变化显示，病鱼散，空泡化。织切片显示，显，皮下组织毛虫的大量示，正常鳃病症状 A）感染组织涂片ected turbotphthalmos (s indicate th化鱼皮肤、鳃正常鱼皮织和肌肉组量繁殖，组织鳃丝结构紧）体表溃烂处片；D）纤t associated(Arrows indhe ciliates).ciliate.、肝脏、肠皮肤组织结构组织中有大量织坏死，细胞密、规整（处；B) 眼球纤毛虫显微特with ciliatedicate the foD) Microsc肠及脑组织均构紧密（图量纤毛虫，胞核固缩、（图 2-2 C）球凸出（箭头特征。es. A) Ulceroci). C) Smecopical char均感染了大图 2-2 A），纤组织内部有碎裂、溶解，纤毛虫侵头指示病灶rative lesiears maderacteristic大量纤毛虫纤毛虫入有明显的解（图 2-2侵入鳃丝后

皮肤,空间,纤毛虫,泡化

大得E））感入侵致病icriliatose.t def. F)) Citruct大菱鲆器官组得松散；C）正）正常鳍组感染纤毛虫侵导致肠绒毛病鱼脑组织oscopic patte. B) CiliatC) Normalformation anCiliates in tiliates (arrowture without组织病理变正常鳃丝切组织切片；F后，肝组织毛细胞变形降解，空泡hological chtes (arrows)gill filamennd strong dithe fin of inws)caused dt ciliate. J) I变化 A）正常切片；D）感）病鱼鳍组织裂解，空泡形坏死；K）泡化（箭头hanges of in) in skin tissnt without cilatation ofnfected turbodisintegratioInvasion of常皮肤组织感染纤毛虫后组织切片出泡化；I）正正常脑组指示盾纤毛nfected turbsue of infectciliate.D) Cispace. E) Not. G) Normon of liver tf ciliates (arr切片；B）感后，鳃丝细现纤毛虫；正常肠绒毛织切片；L毛虫，标尺bot. A) Normted turbot, tiliates (arroNormal fin timal liver tisstissues. I) Nrows) led to感染纤毛细胞严重G）正组织切）纤毛尺=25μmmal skinthe skinows) cauissue wsue withNormal bo necros

纤毛虫,形态特征,变异系,中值

mmm最小值(μm) 20(μm) 5(μm) 24(μm) 10m) 12比例 0.3数 10m) 8m) 4小最大值0 3010360 162 154 0.5012109平均值25.0930.912.813.30.4410.69.17.3中值标准差 S25 3.110 1.632 4.114 2.313 1.20.44 011 0.69 0.98 1.8准SD变异系CV1 12.36 17.91 13.43 18.02 9.310.36.09 9.78 24.0系Vprotargol staining method)

【参考文献】