钙离子浓度对三角帆蚌外套膜和内脏团细胞内钙含量及碳酸酐酶的影响

发布时间：2020-08-26 00:12

【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我国重要的淡水育珠蚌,是我国珍珠产业的首选贝类。珍珠光滑有光泽,但实际出的珍珠良莠不齐,关键是珠质沉积所致。。而珠质的主要成分为碳酸钙(CaCO3)。为了探究形成碳酸钙结晶的钙离子在体外的来源,在体内的转换、转运及合成,本实验一方面使用流式细胞术结合钙离子探针检测在插核120天期间不同时期内不同钙离子浓度环境下外套膜和内脏团细胞吸收钙离子并滞留细胞的含量;另一方面检测相应情况下三角帆蚌α-碳酸酐酶基因(HcCA)表达量、蛋白表达量和总碳酸酐酶酶活性。最后对插核120天后不同钙离子浓度下培养的三角帆蚌取珠分析珍珠表面沉积状况,旨在探讨HcCA的基因表达、蛋白表达量及酶活性探讨其与三角帆蚌外套膜和内脏团细胞内钙离子含量与其HcCA的基因表达、蛋白表达量及酶活性之间的关系。主要结果如下:1.HcCA在插核后在内脏团和外套膜中的基因表达量分析及Western Blot蛋白分析(1)研究发现,在每一个取样的时间节点,0mm与0.5mm浓度处理组的hcca表达量均处于较低水平,第20天,随着ca2+浓度上升hcca表达量也逐步上升(p0.05),50天、90天、120天1.25mm、2mm的hcca表达量显著高于其他浓度处理组(p0.05)。当ca2+浓度升高到3mm时hcca表达量均出现不同程度显著下降(p0.05)。从每个浓度角度分析发现,50天时的hcca表达量也显著高于其他浓度组。所有hcca基因表达都显示,外套膜中hcca基因表达量显著低于相应时期和浓度下的内脏团表达量(p0.05)。(2)westernblot实验结果验证了hcca基因在不同浓度不同时期的表达量2.三角帆蚌外套膜和内脏团细胞内钙离子含量的流式细胞仪检测分析(1)本实验将培养4个月后的三角帆蚌外套膜和内脏团组织加入胰酶37度水浴消化后,加入fluo-4/am溶液37°c孵育30min,pbs溶液、胰酶消化液、孵育液均使用cacl2调节溶液钙离子浓度与培养时水体一致。最后流式细胞仪中用488mm激发,fli-h荧光通道收集荧光信号,慢速收集104个细胞。在分析流失数据前应先根据细胞分群设门以排除细菌及消化过度的细胞碎片影响。设门完成后使用fl1-a对fl1-h作图,再次设门以排除未完全消化的非单个细胞。最后用fl1-h对count作图统计钙离子含量。(2)本实验用平均荧光强度代表细胞内钙离子含量,流式细胞仪数据统计发现外套膜细胞内钙离子荧光强度在0mm到2mm浓度均呈显著上升趋势(p0.05),荧光强度在2mm浓度达到顶峰,而在3mm浓度出现显著下降(p0.05)。内脏团细胞中钙离子荧光强度随浓度变化趋势与外套膜细胞相同,但整体荧光强度大于外套膜细胞,且差异显著(p0.05)。3.三角帆蚌内脏团和外套膜组织中碳酸酐酶活性在不同环境钙离子浓度下差异分析(1)本实验从培养4个月后不同浓度体系中蚌中取出外套膜和内脏团组织使用含pmsf的强裂解液提取蛋白随后在分光光度计中依次加入1.9ml15mmol/ltris-h2s04缓冲液(ph7.6),0.1ml的酶液和1ml3mmol/l的乙酸对硝基苯酯,室温反应5min后在348nm处用分光光度计测定其吸光值,以不加酶液的为空白对照,酶活定义为:在室温下,每分钟水解1μmol乙酸对硝基苯醋所需的酶量为一个酶活单位.最后比上测得的样品蛋白含量,作为单位酶活性。(2)本研究发现外套膜及内脏团中的碳酸酐酶活性在环境钙离子浓度为0mm-0.5mm时,均显著高于1.25mm-3mm环境浓度的活性(p0.05)。并且1.25mm、2mm、3mm环境浓度浓度的碳酸酐酶活性差异是不显著的(p0.05)。此外,研究发现外套膜中的碳酸酐酶活性均显著高于内脏团(p0.05),同样是0.5mm浓度处理组酶活性最高(p0.05),但3mm处理组酶活性高于1.25mm、2mm浓度处理组(p0.05)。4.不同环境钙离子浓度养殖下三角帆蚌珍珠质沉积的观察与研究本研究用扫描电镜分析珍珠表面形态结构发现在外套膜插核育珠180天后,当钙离子浓度为0 mM时,会出现不规则的碳酸钙沉积;当钙离子浓度高于0.5 mM,碳酸钙在珠核上的沉积越来越规则而紧密;当浓度达到3 mM时,表面变得粗糙,规则多边形的沉积结构开始消失。在内脏团插核育珠180天后的珍珠电镜结果显示,无论是高浓度还是低浓度的钙离子环境,碳酸钙的沉积都非常不规则,珍珠表面不平整,容易出现裂痕。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【图文】：

上海海洋大学硕士学位论文细胞外的矿化界面。二者在胞外矿化界面上形成最终矿化产物时均需要有的指导[7]。整个生物矿化过程中有三种重要的调控保证矿化的有序进行，基因调控、生化调节以及生物能量的供给。而且，环境因素也对矿化过程的影响。所有这些因素共同组成了一个复杂的相互作用的调控网络参与生的调节(图 1-2)。具体来说，生物矿化的调控至少包括空间控制、化学控制控制、结构控制及构造控制等几种重要的方式[7]。

图 1-1 生物矿化的一般模型(Mann, 2001)Fig.1-1 General model of biological mineralization(Mann, 2001)

图 1-3 软体动物的矿化系统示意图(戴永定，1994).1-3 Schematic diagram of the mineralization system of mollusc(戴永定，1贝类生物矿化作用的最终产物是贝壳或珍珠，国内外学者对贝壳与珍珠从 18 世纪初就已经开始，第二次世界大战后，随着放射性同位素的应进展更是尤为迅速[9]。由于研究珍珠的形成一般需要进行插核等实验，技术在 20 实际 60 年代才被推广开。并且还要求研究者具备临近大型养

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本文编号：2804386