对虾Coat-ε、CCAP17和CHC的克

发布时间：2020-08-28 14:50

　　 本文以中国明对虾Coat-ε、凡纳滨对虾Clathrin coat AP17和对虾Clathrin heavy chain(CHC)为研究对象,分别克隆出它们的基因序列全长,并进一步研究了它们在WSSV侵染中的作用。主要包括以下三个部分:第一部分:采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end,RACE)技术,扩增出中国明对虾Coat-ε基因的3’端和5’端序列,拼接获得基因全长序列1402 bp,其中开放阅读框1008 bp,预测编码335个氨基酸,此氨基酸没有信号肽和跨膜结构。构建系统发育树。coat-ε在各组织中都有表达,肌肉中的相对转录表达量最高。构建了coat-ε重组表达载体,SDS-PAGE检测表达的蛋白显示条带与预期大小相符,质谱分析确认重组蛋白为Coat-ε。Far-Western blotting和ELISA分析显示Coat-ε蛋白与WSSV结构蛋白VP26、VP28N、VP28C有结合作用。流式细胞分析及细胞ELISA结果表明,Coat-ε蛋白抗体抑制WSSV与血细胞的结合,体内中和试验表明Coat-ε与WSSV及其早期基因ie1和晚期基因vp28基因表达密切相关,Coat-ε抗体延缓了WSSV对对虾的感染。第二部分:采用RACE法扩增出凡纳滨对虾Clathrin coat AP17(LvCCAP17)的3’端和5’端序列,序列全长842bp,预计编码142个氨基酸,生物信息学分析表明此氨基酸没有信号肽和跨膜结构。构建系统发育树。荧光定量PCR分析LvCCAP17在凡纳滨对虾各组织中均有表达。感染WSSV后在上皮和肝胰腺组织中LvCCAP17转录水平的表达量明显上升。构建LvCCAP17重组表达载体,SDS-PAGE检测表达的蛋白显示条带与预期大小相符,质谱分析确认重组蛋白为CCAP17。Far-Western blotting和ELISA分析显示,LvCCAP17与WSSV的结构蛋白VP26、VP37具有结合作用。RNA干扰(RNAi)实验表明AP17基因沉默后,感染WSSV的对虾累积死亡率降低,并且ie1和VP28基因的转录表达下降。这些结果显示,网格蛋白介导的内吞作用参与WSSV的感染。第三部分:通过GeneBank上发布的斑节对虾网格蛋白重链(CHC)设计引物,扩增中国明对虾网格蛋白重链(Fenneropenaeus chinensis clathrin heavy chain,FcCHC)和凡纳滨对虾网格蛋白重链(Litopenaeus vannamei clathrin heavy chain,LvCHC)序列全长。获得LvCHC和FcCHC序列全长是5052 bp,预计编码1684个氨基酸。生物信息学分析表明,LvCHC和FcCHC均为疏水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,LvCHC和FcCHC的功能域与其它物种有差别。RNAi实验表明,CHC沉默后,凡纳滨对虾感染WSSV的累积死亡率降低,说明CHC可能参与WSSV感染宿主细胞的过程。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S945.4

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本文编号：2807714