基于转录组分析探讨刀鲚幼鱼对环境因子变化的响应及调控机制研究

发布时间：2020-09-01 14:55

　　刀鲚(Coilia nasus)(同物异名C.ectenes),属鲱形目(Clupeiformes),溊科(Engraulidae),鲚属(Coilia),是我国长江一种重要的溯河洄游型鱼类。每年春季成熟个体,沿江上溯进行生殖洄游。当年孵化出的幼鱼顺江而下,入海以完成生长及育肥。刀鲚其味道鲜美,与鲥鱼、暗纹东方渶并称为“长江三鲜”,广受人民喜爱,历史上资源量曾十分丰富,但近年来,由于水利工程的过度兴建以及环境污染等所导致的刀鲚生态环境的破坏,人为不科学捕捞等都致使其野生资源遭到了极大破坏,资源量严重锐减。开展刀鲚洄游机理的探究对于刀鲚野生资源恢复具有积极作用,但至今该方面研究较少,仅见于刀鲚嗅觉上皮的转录组研究及相关基因(如嗅觉上皮受体等)的克隆及功能研究。升盐、降温、饵料丰度是刀鲚幼鱼在降海洄游中所需经历的关键环境因子,但尚未见有关相关机理方面的研究报道。高通量测序技术,又称为第二代测序技术,相比第一代测序技术来讲,具有测序速度快、准确性高、信息量大的显著特点。可以使研究者在更广阔同时又更为深刻的层面上来探讨生物体在某一特定生理状态下机体的全部转录本表达情况,是现代分子生物学研究的重要方法。因此,本研究基于高通量测序法以升盐、降温、饥饿作为实验因子选取脑组织以及肝组织这两个机体调节中枢以及能量代谢中心来探讨在环境因子作用下刀鲚鱼体的调控机理。本研究结果旨在为今后进一步探讨刀鲚在洄游中对盐度、温度以及饵料等环境因子变化的鱼体分子调控机制提供理论参考。本研究首先开展了降温与升盐协同作用对刀鲚幼鱼脑组织转录组的影响研究。采用提取总RNA富集获得mRNA,扩增构建cDNA文库,进行Illumina高通量测序,对于获得的转录读本进行装配。而后通过与NR、SWISSPROT和KOG数据库进行比对,获得蛋白注释信息,进行GO富集分析以及KEGG通路分析。计算基因的相对表达量,筛选出差异表达基因,基于差异表达基因,进行GO功能显著性富集分析和KEGG通路显著性富集分析。本研究中共获得了 4,721个差异表达基因,其中2,028个基因上调表达,2,693个基因下调表达。进一步分析,获得了差异最显著的Topl0GO注释条目。结果表明,差异富集最显著的基因群主要涉及“突触传导”、“神经信号传导”等生物过程,“钙离子结合活性”、“G蛋白偶联受体活性”等信号转导相关分子功能,位于“胞外区”、“细胞连接”及“突触后膜”、“突触小泡膜”等细胞部位。显著富集的KEGG调控通路也多为集中在信号转导相关,包括“神经活性配体-受体互作”、“钙通路”、“谷氨酸能突触传导”以及免疫方面,如“造血细胞系”。差异表达基因主要涉及信号转导通路中的相关受体、调控蛋白及亚单位,渗透调节中的各类通道蛋白、转运体,应激应答涉及各类调控因子及酶等。最后开展了荧光定量PCR进行验证,实验结果与转录组测序结果相一致,也体现了本研究结果的准确性。本研究也开展了饥饿作用对刀鲚幼鱼肝组织转录组的影响研究。采取如实验一所采取的提取RNA,建库、测序、装配、注释、进行差异表达基因的富集分析。我们共获得了2,746个差异表达基因,其中1,317个基因上调表达,1,429个基因下调表达,将注释的基因进一步进行差异表达分析,最终获得“生物过程”、“细胞组分”以及“分子功能”三个功能群中差异表达最显著的Topl0GO条目。在“生物过程”类群中,差异表达最集中的条目涉及“DNA集合”、“免疫应答”、“脂类代谢过程”、“消化”以及补体激活等。在“分子功能”类群中,差异表达基因则集中在“RNA指导的DNA聚合酶活性”、“天冬氨酸型内切酶活性”、“核酸结合”以及“碳水化合物结合”等。在“细胞组分”类群中,差异表达基因主要集中在“胞外区”、“内质网膜”、“细胞表面”以及“受体复合物”等条目。差异表达基因显著富集通路大体涉及四类,能源物质代谢相关,涉及“脂肪消化与吸收”、“蛋白质消化与吸收”、“糖酵解与异生”。激素代谢相关通路,如“类固醇激素生物合成”。信号转导相关,如“神经配体-受体互作”、“过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路”。免疫应答相关,包括“细胞因子及其受体互作”、“补体与凝血级联”等。差异表达基因也是主要集中在上述三方面。最后进行了荧光定量验证试验,结果表明实验结果与转录组分析结果一致,体现了本研究结果的准确性。本研究在开展的温度与盐度协同作用对刀鲚脑组织转录组研究中,筛选出了在此过程中发挥重要调控作用的核因子相关因子2。核因子相关因子2是一种具有广泛调节作用的抗应激转录因子,是CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族中活性最强的成员之一。在应激因子出现后,将启动下游抗应激相关基因的转录表达。本研究对其进一步开展了分子克隆、进化分析以及分别在升盐、降温作用下的差异表达研究。研究结果表明核因子相关因子2具有其家族中典型的亮氨酸拉链保守基序以及糖基化位点等保守位点。其与同属鲱形目的大西洋鲱具有最为接近的进化距离。其在升盐、降温作用下均出现了显著上调表达,也体现了其在刀鲚抗升盐、低温作用中所发挥的积极功用。在脑组织转录组的研究中还筛选出了另一种重要调控蛋白-水通道蛋白1。它是协助水分子及甘油、氨等溶质小分子跨膜运输的膜整合蛋白,对于机体的渗透调节及抗应激调节发挥重要作用。本文对其进一步开展了分子克隆、进化分析以及分别在升盐、降温作用下的差异表达研究。研究结果表明水通道蛋白1具有水通道蛋白家族典型的6个跨膜结构域,还具有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸特征序列。与大西洋绯的水通道蛋白1序列具有最近的进化距离。同时其在升盐、降温作用下均出现了显著上调表达,体现了其在刀印鲚章抗升盐、低温作用中所发挥的渗透调节及抗应激功用。在开展的饥饿作用对刀鲚幼鱼肝组织转录组的影响研究中,脂蛋白酯酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶在最显著富集的关键调控通路即糖、脂代谢通路中发挥重要调节作用,本文对其开展了分子克隆及差异表达研究,结果表明,脂蛋白酯酶具有酯酶家族典型的N-糖基化位点、脂质结合位点以及由天冬氨酸-丝氦酸-组氦酸组成的催化中心。其也与大西洋鲱的相关序列具有最近进化距离。磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶具有保守的结构域,包括与草酰乙酸结合结构域以及与GTP结合的两个激酶基序。与大西洋鲱相关序列具有最为接近的进化距离。同时脂蛋白酯酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶二者在饥饿作用下均出现了显著表达,体现了它们对刀鲚鱼体的能量代谢调控中所发挥的积极作用。综上所述,本研究采用高通量测序法以温度、盐度、饥饿这三个在刀鲚幼鱼行降海洄游中所需经历的环境因子作为实验因子,首次系统性开展了它们对相应关键调控组织包括脑组织、肝组织的转录组研究。本研究显示在温度与盐度协同作用对刀鲚幼鱼脑转录组影响过程中,最为显著富集的功能通路为信号转导以及抗应激相关,同时还可以发现诸多在此过程中发挥重要调节功用的功能基因。同时,在饥饿对刀鲚肝转录组的影响过程中,最为显著富集的功能通路集中在能源物质代谢包括糖、脂、蛋白质代谢以及免疫应答。此外,在刀鲚响应升盐与降温协同作用的过程中,通过脑转录组分析还筛选到了核因子相关因子2和水通道蛋白1两个调控基因,并进一步确认了其在温度、盐度等环境因子调控中所发挥的积极作用。本研究的相关转录组数据已提交到了 NCBI。本研究的结果将可以为今后进一步探寻刀鲚洄游中鱼体应答与调控机理奠定理论基础,同时为其它洄游性鱼类的洄游分子机理的探寻提供理论参考。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

基因,转导机制,分子伴侣

逑２．２．２基因ＫＯＧ注释逡逑基因的ＫＯＧ注释结果如图２－１所示。ｕｎｉｇｅｎｅ被注释到了邋２５个功能群中。其中，逡逑注释数目最多的条目为“信号转导机制”，其余注释数目较多的为“转录，翻译后修逡逑饰，分子伴侣”以及“转录”。这些均与信号转导等分子调控机制相关。其中，１３，２０９逡逑个基因与“信号转导机制”相关，６，１４１个基因与“转录，翻译后修饰，分子伴侣”逡逑相关。逡逑８逦■逦Ａ邋ＲＮＡ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑Ｓ邋￣｜逦■逦Ｂ逦Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｄｙｎａｍｉｃｓ逡逑＿邋Ｃ邋Ｅｎｅｒｇｙ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ逡逑ｇ逦□邋Ｄ邋Ｃｅｌｔ邋ｃｙｃｌｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ，邋ｃｅｌｌ邋ｄｉｖｉｓｉｏｎ，邋ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ邋ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ逡逑ｃ邋８邋＿逦□逦Ｅ逦Ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑ｇｊ邋ｏ邋－逦Ｏ逦Ｆ逦：邋Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑？ｒｉ逦■逦Ｇ邋：邋Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｎｉ逡逑兰逦■邋Ｈ邋Ｃｏｅｎｚｙｍｅ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑８逦■邋Ｉ邋：邋Ｌｉｐｉｄ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑ａ逦＿逦Ｊ邋Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ

温度盐度,差异表达基因,热图,实验组

逑２．２．３差异表达基因的聚类分析逡逑如图２－２所示，以ｌｏｇ２ＦＰＫＭ进行聚类，红色代表高表达量基因，绿色代表低表逡逑达量基因，对照组与实验组的基因分别聚类，同时对照组与实验组的各平行组之间基逡逑因表达量较为一致。逡逑Ｓ逦Ｓ逦Ｓ逦Ｓ逦Ｓ逦§逡逑—逦ｔｏ逦ＣＯ逦—逦ｔｏ逦ＣＯ逡逑图２－２温度盐度协同作用下对照组与实验组所有差异表达基因的聚类热图逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｈｅａｔ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＤＥＧｓ邋ｉｎ邋ｂｒａｉｎ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ邋ｏｆ邋Ｃ．ｎａｓｕｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｅｌｅｖａｔｅｄ邋ｓａｌｉｎｉｔｙ邋ａｎｄ逡逑ｌｏｗ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ｅｆｆｅｃｔ逡逑以ｌ0ｇ２ＦＰＫＭ进行聚类，红色代表高表达量基因，绿色代表低表达量基因，红到绿表示逡逑表达量由高至低．逡逑ＤＥＧｓ邋ｗｅｒｅ邋ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ邋ｂｙ邋ｌｏｇ２ＦＰＫＭ邋ｖａｌｕｅ．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｄ邋ｃｏｌｏｒ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ＤＥＧｓ邋ｗｉｔｈ邋ｈｉｇｈ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｇｒｅｅｎ邋ｃｏｌｏｒ邋ｓｈｏｗｅｄ邋ｔｈｅ邋ＤＥＧｓ邋ｗｉｔｈ邋ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ．逡逑２．２．４差异表达基因的ＧＯ富集分析逡逑将转录本与ＧＯ数据库进行比对，３８，５７９基因注释到了邋６２个功能条目中。包括逡逑生物过程，分子功能以及细胞组分三个亚类，而后进行基因差异表达分析，最终获得逡逑２４逡逑

序列,名称,基因,纵坐标

逑２．２．７荧光定量ＰＣＲ验证逡逑设计的特异引物序列如表２－４所示，开展荧光定量ＰＣＲ验证试验，结果如图２－５逡逑所示。结果表明检测的１０个差异基因其表达趋势与转录组测定结果是一致的。逡逑＾逦口荧光定量ＰＣＲ邋ｑＰＣＲ逡逑§邋１４「逦ＥＤ邋高通量测序＂ｌｕｍｉｎａ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑＾邋１２逦－逦ｍ逡逑％邋１０逦－逦Ｉ逡逑汔８逦－曑逦ｆ１！？丨逦W逡逑．２邋６邋－＊１逡逑Ｘ逦丨邋￥逦Ｉｊｉｊ逦ｒ＾ｉｌｊ：逡逑舍邋４邋一邋Ｉｆｌ逦Ｆ逡逑Ｉ邋0邋￣１邋１１１，邋ｈｉｌｌ，邋Ｍｉｌ，逦，邋ｎｉ邋，逦，邋Ｕｌｌ，邋ｒｉＢ邋，邋Ｈｐ邋．邋ｈｉ邋．逡逑Ｍ邋－２邋￣逦Ｕ邋ｉｌ逡逑故－４邋－逦W逡逑Ｍ邋－６邋－逡逑塞逡逑基因Ｇｅｎｅｓ逡逑图２－５实时荧光定量ＰＣＲ验证逡逑Ｆｉｇ．２－５邋ＤＥＧｓ邋ｖａｌｉｄａｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑横坐标为基因名称，纵坐标为相对表达量．逡逑Ｔｈｅ邋ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ邋ａｘｉｓ邋ｓｈｏｗｅｄ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｉｄａｔｅｄ邋ＤＥＧｓ．邋Ｔｈｅ邋ｖｅｒｔｉｃａｌ邋ａｘｉｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＥＧｓ．逡逑２９逡逑

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