西太平洋雅浦海沟贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）DH82的分离、鉴定及其抗菌蛋白初步研究

发布时间：2020-09-25 19:23

　　当前,我国水产养殖过程中出现了诸多的病害问题,其中以水产致病细菌引发的病害问题尤为严重,其爆发性强、来势迅猛。如何能有效防治水产病害是水产养殖业面临的重要任务。传统上,防治水产细菌性病害的重要手段是化学抗生素或化学药物,化学抗生素或化学药物确实在一定程度上解决了细菌性病害问题,但使用化学抗生素或化学药物往往会带来病原菌耐药性、水产品药物残留和环境污染等问题,因此,寻找无污染、无耐药性和无公害的化学抗生素或化学药物替代物成为解决问题的关键。深海芽孢杆菌代谢途径多样性及顽强的生命力,赋予了其具有分泌新型抑菌活性物质的能力。从深海芽孢杆菌中分离出能拮抗水产致病细菌且无公害、无耐药性的蛋白,是当前防治水产病害的研究热点。本论文针对我国突出的水产细菌病害和水产品安全问题,通过对西太平洋雅浦海沟的水样筛选,获得对水产病原细菌强拮抗作用的菌株,对菌种发酵培养,通过硫酸铵分级沉淀和葡聚糖凝胶层析法获得具有抗菌生物活性的蛋白,该蛋白具有较好防治水产病原细菌的能力,可作为化学抗生素或化学药物替代物解决水产细菌性疾病问题。研究的主要结果如下:1.拮抗水产细菌病害DH82菌株筛选分离及鉴定本论文用加热处理、梯度稀释法,结合形态学观察从西太平洋雅浦海沟6000米深的水样中分离出106株芽孢杆菌,对其进行拮抗水产病原细菌的初筛实验,筛选出79株拮抗菌;然后,再对拮抗菌活性产物是否是蛋白进行复筛,得到具有高抗菌蛋白活性的DH82菌株。DH82菌株鉴定采用形态学观察、生理学和生物生化特性研究以及分子生物学分析三者相结合的方法。最后鉴定DH82菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。2.贝莱斯芽孢杆菌DH82抗菌粗蛋白制备及理化性质研究为进一步研究抗菌活性物质的性质,用改良LB培养基培养贝莱斯芽孢杆菌DH82,研究贝莱斯芽孢杆菌DH82生长特性,确定其产抗菌蛋白的最佳发酵时间为24 h。通过硫酸铵分级沉淀法获取抗菌蛋白,确定最佳硫酸铵沉淀饱和度为70%。研究了抗菌粗蛋白理化性质,以迟缓爱德华氏菌作为指示病原细菌,结果发现贝莱斯芽孢杆菌DH82的抗菌粗蛋白热稳定性较强,对蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶都不敏感,在pH7.0抑菌活性最佳,金属K~+、Na~+促进抗菌粗蛋白活性,金属Mg~(2+)、Fe~(3+)部分抑制抗菌粗蛋白活性,金属Ca~(2+)严重抑制其抑菌活性。3.抗菌粗蛋白初步分离纯化及其抑菌谱检测通过对贝莱斯芽孢杆菌DH82的抗菌粗蛋白进行Sephadex G-75柱层析分离纯化,获得两个具有抑菌活性的峰蛋白PrI和PrII。两个峰蛋白PrI和PrII经抑菌谱检测,发现对常见水产指示病原细菌包括迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌都具有较好抑菌活性,说明深海贝莱斯芽孢杆菌DH82产生的抗菌粗蛋白对水产病原细菌的抑菌谱较广,其中峰蛋白PrII对指示植物病原真菌水贼镰刀菌也具有较好抑菌作用。再进一步对峰蛋白进行最低抑菌浓度(MIC)检验,发现其对迟缓爱德华氏菌和溶藻弧菌的MIC都较低(为7.16μg/mL)。因此,得出深海贝莱斯芽孢杆菌DH82具有较广的抑菌谱及较强的抑菌活性,预示该菌株在常见水产细菌性及个别植物真菌性病害防治上有较好的开发利用价值。
【学位单位】：自然资源部第三海洋研究所
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S941.42
【部分图文】：

嗜水气单胞菌,抑菌活性,副溶血弧菌,溶藻

图 2-1 部分活性菌株的抑菌活性Fig. 2-1 The antimicrobial activity of partial active strainsa 嗜水气单胞菌 b 迟缓爱德华氏菌 c 坎氏弧菌 d 副溶血弧菌 e 溶藻弧d-2 e-2

革兰氏染色,菌株,生理生化特性

DH82菌株的革兰氏染色Fig.2-2TheGramologicalphotographofstrainDH82

序列,系统进化树,序列

图 2-3 基于 16S rDNA 序列 BLAST 结果构建菌株 DH82 的系统进化树Fig. 2-3 Phylogentic tree of strain DH82 based on BLAST results of 16S rDNAsequence

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