齐口裂腹鱼食欲调节因子与mTOR信号通路调控摄食的机制初探

发布时间：2020-11-12 00:27

　　 本研究以齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)为对象,对食欲调节因子和mTOR信号通路在鱼类摄食调控中的作用和机制进行了初步探讨。试验首先克隆齐口裂腹鱼食欲调节基因(apelin,APJ,proglucagon和NUCB2)和mTOR信号通路基因(mTOR,S6K1,S6,4E-BPl,4E-BP2和4E-BP3);继而采用实时荧光定量PCR的方法,检测它们在齐口裂腹鱼17种组织中的分布情况;分析食欲调节基因在不同摄食状态下的表达模式;最后研究腹腔注射mTOR的激动剂(亮氨酸,L-leu)和抑制剂(雷帕霉素,RAPA)对齐口裂腹鱼摄食量以及食欲调节基因和mTOR信号通路基因表达的影响。1.齐口裂腹鱼食欲调节基因克隆、组织分布和不同摄食状态下的表达研究本试验克隆得到齐口裂腹鱼食欲调节基因:apelincDNA全长1001bp,编码77个氨基酸,包含22个氨基酸的信号肽;Apelin受体一APJ cDNA核心片段1080 bp,编码359个氨基酸,具有7个跨膜结构域;proglucagon cDNA核心片段504 bp,编码121个氨基酸,包含21个氨基酸的信号肽;NUCB2 cDNA全长2140 bp,编码487个氨基酸,包含23个氨基酸的信号肽。Apelin及其受体APJ mRNA在齐口裂腹鱼的各组织广泛表达,表达模式基本一致,主要表达部位是心脏、脾脏和脑。proglucagon mRNA主要在肠道和脑表达,其它组织表达量较低。NUCB2mRNA主要表达部位是肝胰脏,其它组织也广泛表达。摄食后1小时和3小时,齐口裂腹鱼下丘脑apelin和APJ mRNA表达水平显著降低(P0.05),肠道和下丘脑proglucagon和NUCB2 mRNA表达水平显著升高(P0.05,P0.01)。禁食7天内,下丘脑apelinmRNA水平显著升高(P0.05),下丘脑 proglucagon 和 NUCB2 及肠道proglucagon mRNA 水平显著降低(P0.05,P0.01),而肝胰脏NUCB2 mRNA水平显著升高(P0.01);3天禁食显著增加APJ mRNA表达(P0.05),但是禁食5天和7天的APJ mRNA表达与对照组无显著差异(P0.05)。复投喂当天,apelin和APJmRNA水平显著低于按时投喂的对照组(P0.05),复投喂第3天,二者均恢复到正常水平;复投喂后,proglucagon和NUCB2mRNA表达与对照组均无显著差异。结果提示:apelin和APJ作为促食欲因子,proglucagon和NUCB2作为饱食因子参与齐口裂腹鱼的摄食调控。2.齐口裂腹鱼mTOR信号通路基因克隆、组织分布和摄食调控机制初探本试验克隆得到齐口裂腹鱼mTOR信号通路基因:mTOR cDNA全长8046 bp,编码2515个氨基酸;S6K1 cDNA核心片段1084 bp,编码310个氨基酸;S6 cDNA全长860 bp,编码249个氨基酸;4E-BP1核心片段363 bp,编码120个氨基酸;4E-BP2核心片段342 bp,编码113个氨基酸;4E-BP3核心片段336 bp,编码111个氨基酸。序列比对发现,mTOR信号通路基因的氨基酸序列在脊椎动物间均高度保守。组织分布结果表明,mTOR信号通路基因在齐口裂腹鱼各组织均高度而广泛的表达。提示mTOR信号通路基因在不同组织中可能发挥多重生物学功能。与对照组相比,腹腔注射4小时后,RAPA(lmg/kgBW)可显著增加齐口裂腹鱼的摄食量(P0.05),L-leu(10mg/kgBW)降低摄食量不显著(P0.05)。腹腔注射L-leu和RAPA对齐口裂腹鱼mTOR信号通路基因mRNA表达的影响大多不显著(P0.05)。但是,腹腔注射L-leu后,肝胰脏和肠道ghrelinmRNA水平分别下降至对照组的1/8和2/5(P0.05);腹腔注射RAPA后,下丘脑、肝胰脏和肠ghrelin mRNA水平分别是对照组的1.4倍、5倍和16倍(P0.05)。此外,注射L-leu上调了下丘脑POMC和NPY,肝胰脏NUCB2、leptin和CCK,及肠NUCB2的表达水平(P0.05);下调下丘脑AgRP的表达水平(P0.05)。注射RAPA下调了下丘脑POMC和AgRP的表达水平(P0.05),上调肠proglucagon和CCK的表达水平(P0.05)。注射L-leu和RAPA都不影响下丘脑apelin、APJ、NUCB2和CRH的表达水平。结果提示:腹腔注射L-leu(10mg/kgBW)和RAPA(1mg/kgBW)4小时后,齐口裂腹鱼摄食调控与ghrelin和POMC基因表达水平改变有关,与mTOR信号通路基因转录水平无关。综合上述结果,得到如下结论:apelin和APJ作为齐口裂腹鱼促食欲因子,proglucagon和NUCB2作为饱食因子参与摄食调控。腹腔注射L-leu(10 mg/kgBW)和RAPA(1 mg/kgBW)4小时后改变ghrelin和POMC基因表达,从而调控齐口裂腹鱼摄食。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

在差异ｍＴＯＲＣｌ对ＲＡＰＡ极其敏感，主要通过对氨基酸、应激、氧气、能量和??生长因子等信号输入产生应答效应，诱发合成代谢过程和抑制分解代谢过程来促进细??胞生长，驱动细胞周期进程ｍＴＯＲＣ２对急性的ＲＡＰＡ处理不敏感，但是长期暴??露在其中能够破坏它的结构，主要通过对生长因子产生应答效应，调控细胞存活和新??陈代谢Ｗ及细胞骨架肌动蛋白的重新组装??２．２．３巧巧化位点??蛋白磯酸化是蛋白激酶将踞酸基团转移到特定底物蛋白上的共价修饰过程，调控??蛋白质的酶学活性或生物学功能。蛋白激酶分为二类，即丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶和??酪氨酸蛋白激酶。ｍＴＯＲ是在真核生物间高度保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，其复??合体能够高度磯酸化，通过质谱法可Ｗ分析蛋白质的憐酸化位点１４３１。目前，ｍＴＯＲ??被确认的麟酸化位点有?６?个；Ｓｅｒ＇ｗ、Ｓｅ户５９、Ｔｈｒ２＾、Ｔｈｒ＾６、Ｓｅｒ２ｗ和?Ｓｅｒ２ｗＷ＂＊８ｌ。??Ｓｅｒｉｗ位于Ｎ－端的ＨＥＡＴ重复序列，Ｓｅｒ２ｉ５９和Ｔｈｒ２＾位于激酶域，其余３个位点均??位于Ｃ－端的负调节域（见图１－２）。??……?…?Ｓ針?１２６１?ＴｈｒＷＭ?３＾４８１??

３．３齐口裂腹鱼ＮＵＣＢ２基因的组织表达模式??ＮＵＣＢ２在齐口裂腹鱼的各组织中广泛表达。主要表达组织为齐曰裂腹鱼的肝膜??，其余组织均检测到ＮＵＣＢ２表达；琼脂糖凝胶电泳图显示ＮＵＣＢ２的组织表达模??与实时焚光定量ＰＣ民检测结果一致（见图２－１３）。??曼?１－２??Ｉ?１??＆?０．８?ｉ??＜??含?０．６?．．??！?：?１?ｈ?ｉ，ｉ?ｒ出??１?兴４户车。、＊气々沁＞＾咬受＾护。４沪??次＜？?＾?Ａ??ＮＵＣＢ２?｜＾ｙ＾ｌ２３ＤＢＱＢＳＢＢ！Ｅ３ＢＳＢ５ＥＳＤＢＥ９??

在垂体、皮肤和肠道等组织中表达较低（见图２－１０和２－１１）。??Ｓ?１．２?１??〇??Ｉ?．１１??Ｓ?０．６?－?＾?Ｉ??Ｉ。Ｉ?Ｉ??１ＩＩ?｜｜＿｜｜．．．１．．．．??弁、＊气。次Ｖ会＊梦汝户??去。９?於，？＜／?成，??凶２－１０齐口裂腹鱼叩ｅｌｉｎ的紀织特异性表达（ｎ＝１０）??Ｆｉｇ．?２－１０?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ａｐｅｌｉｎ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?扣片ｂｏ化ｏｒｏｘｆ化内口０＇?ｔｉｓｓｕｅｓ??１．２?］??Ｉ?１?Ｔ?Ｔ??苗１－??Ｗ?０．８?－??Ｉ？？ｕ??声。々?声、弟冷公??冷??凶２－ｎ齐口裂腹鱼ＡＰＪ的组织特异性表达（ｎ＝１０）??Ｆｉｇ．?２－１１?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ］?ｅ邱ｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＡＰＪ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?ＳｃＡｂｏ／／／ｏｒａｘ／？ｒｅ＂幻＂ｔｉｓｓｕｅｓ??２．３．２齐□裂腹鱼ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ基因的组织表达模式??如图２－１２所示，ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ主要在齐口裂腹鱼的肠道和脑中表达。在肝族脏、??脾脏、肾脏和性腺中检测少量表达，在也脏、垂体、魄和红肌中有微弱表达，白肌、??皮肤和眼中几乎检测不到其表达。??２５??
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本文编号：2879969