嗜水气单胞菌的分离鉴定及其Hfq功能的研究

发布时间：2020-11-13 12:17

　　 嗜水气单胞菌是引起水产养殖细菌性疾病的一种主要病原菌,对全球水产养殖业带来了巨大的危害和经济损失。同时亦可感染人类,对人体健康造成严重威胁,是—种典型的人-鱼共患致病菌。深入研究嗜水气单胞菌的毒力调控机制对于其引发的病害防治具有重要意义。Hfq是一种广泛存在于细菌体内的sRNA分子伴侣蛋白,可促进不同sRNA分子与其靶标mRNA分子间的相互作用,作为转录后全局调控因子参与细菌的多种生理进程,并对多种病原菌的毒力具有重要的调控作用。本论文从山东烟台养殖鱼场发病石斑鱼体内分离得到一株优势毒力菌株,通过生理生化及分子生物学手段鉴定为嗜水气单胞菌,以该菌株为研究对象,克隆得到其hfq基因序列,利用无标记基因缺失手段成功构建获得△hfq突变株,并进一步研究了Hfq对嗜水气单胞菌不同生理功能及毒力的调控作用,为丰富人们对嗜水气单胞菌毒力调控机制及其科学防治提供理论依据。本论文的研究结果如下：(1)从养殖鱼场发病的石斑鱼胰腺组织中分离到一株优势菌株,通过对其生长特性、生理生化特性等研究,发现分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,可形成β溶血圈：能够发酵利用葡萄糖产酸产气、还原硝酸盐、分解利用麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖等,不能分解枸橼酸盐、木糖、肌醇等；对头孢曲松、磷霉素、等四种极度敏感,对青霉素、氨苄西林等六种不敏感。进一步通过16S rRNA序列克隆比对及系统发育树构建分析发现,该菌和其他已知的嗜水气单胞菌16S rRNA基因序列同源性高达99%以上,并且在进化树上处于同一个分支上,结合生理生化特性确定为嗜水气单胞菌,人工回归感染试验表明分离到的嗜水气单胞菌具有致病性。(2)对嗜水气单胞菌hfq基因进行了克隆,得到264 bp大小的特异性片段,编码88个氨基酸。Hfq蛋白二级结构包含1个由12个氨基酸组成α-螺旋区(H)和32个氨基酸组成的5个β-折叠区(E),其他区域均为无规则卷曲区(-)。Hfq蛋白三维空间结构是一个中空环状的六聚体。成功构建了Hfq重组表达质粒pET28a(+)-hfq,通过诱导表达成功检测到一条大小约为12 kDa的特异性蛋白条带,且其表达量随诱导时间的延长而增加。(3)利用自杀质粒pDM4,通过同源重组的方法成功构建了嗜水气单胞菌的无标记hfq基因框内缺失突变株△hfq。通过对野生型和△hfq突变株不同表型测定发现,在对数生长期内,△hfq突变株的生长相对于野生型有所下降；在进入稳定期后,△hfq突变株的生长达到与野生型相当的水平,并在后期略微有所提高。Hfq对游动性具有正调控作用,对泳动性和溶血活性调控不明显；当Hfq表达受损时,其胞外蛋白酶产量显著提高,即Hfq对嗜水气单胞菌胞外蛋白酶的产量具有明显的抑制作用；此外,hfq基因缺失后,嗜水气单胞菌在30%蔗糖和3%NaCl条件下的生长受到显著抑制；在不同SDS和乙醇浓度下进行培养时,△hfq突变株的生长亦受到一定程度的影响。以斑马鱼为模型进行了嗜水气单胞菌感染实验,结果发现分离菌株具有明显的毒力,当Hfq表达受损时,嗜水气单胞菌对斑马鱼的毒力显著下降。
【学位单位】：陕西科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S941.4
【部分图文】：

图２－１分萬菌株电子显微镜形态??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏ打?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｉｓｏｌａ化ｄ?ｓｔｒａｉｎ??圆??图２－２分离菌袜溶血活性检测??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｈｅ?ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?化ｅ?ｉｓｏｌａ化ｄ?ｓｔｒｉａ打??２．３．２分离苗生理生化特性检测??对分离菌株进行生理生化测定，结果显示分离菌株能够发酵利用葡萄糖产酸产气、??能够还原硝酸盐、分解利用麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、庶糖等，不能分解构嫁酸盐、木??糖、肌醇等（表２－２）。??１４??

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结果显示其由１４３２个碱基所组成。利用ＮＣＢＩ?ＢＬＡＳＴ将所得序列与该数据库??中己公布的其它细菌的１６Ｓ?ｒＲＮＡ进行同源性比对分析，结果显示该序列与其他几个嗜??水气单胞菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列同源性高达９９％Ｌ：ＪＪｉ（图２－３）。在此基础上，根据分离菌??株１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ己登录的其它嗜水气单胞菌１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因序列建立??系统进化树（图２－４），结果显示分离菌株与嗜水气单胞菌在同一个分支上，结合前面的??生理生化结果和形态特征确定菌株为嗜水气单胞菌。??Ｃｏｌｏｒ?ｋｅｙ?ｆｏｒ?ａｌｉｇｎｍｅｎｔ?ｓｃｏｒｅｓ?ＳＥｆｒｏｊｎｔｏｇｉｇｔｉｔ＃＊??—ｍ■遐□—ａ心柳．．．?？???—??????Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?化?Ｔｇ?沁，Ｅ??１?２５０?５００?７５０?１０００?１２５０?＾?＾??Ｚ?＊了＇了艺＾＾？３＞＾３？＂＂?ａｉ？?Ｍｉｗ?巧抓＊?说?Ｈ?巧师?＊做??￣?公历＂＾．＂＊＊＂＊＊?巧獅化?ｗ?病巧视？，??－仰子並?ＷＷｉｉＨＰ?町巧种巧戸ＵＭｆｌｗｇ?扣苗？化（．０?巧?Ｋｆｔｌｉｇ，??三?＆?巧巧化田巧！｜＞＾？１＞８８＞？９０?巧肛化＂巧?＞Ｃｇｌ０ＩＣ，??￣?？＾巧巧ＭｒａｆｉＢｓａｎ?议５?巧＊ＭｆｆｌｔｉｉｇａａａｊＫｔｔｔＭａＭｔｔ?故肪化?Ｍ?９％??￣?ＷＴ左衍病做晰巧飯ｇａＷａｎｔｃＯＴ献巧《〇?巧?Ｓ？?ＫＲ?Ｍ?巧度的Ｗ！??Ｚ?＃Ｔ？本ｇ。ＳＷ?巧?ＷＳｙａＲＷ化鄉巧巧）Ｋ?Ｍ仍ａｍ?＇．??ｒ?巧巧逆巧ｙｔｓｓｏｎ。
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本文编号：2882176