短蛸微卫星标记开发及交配模式与性选择机制研究

发布时间：2020-11-13 13:17

　　 短蛸(Amphioctopus fangsiao)隶属于头足纲,是我国北部沿海最重要的经济种之一,由于市场需求和捕捞强度的增加使得自然资源日渐锐减。短蛸一般一年生,生命周期短,生长迅速,成为开展人工养殖的优良品种。本研究以短蛸为研究对象,成功构建了短蛸均一化全长cDNA文库,进行了微卫星标记开发;利用微卫星亲权鉴定技术研究了短蛸的交配模式,并对其性选择机制进行了探讨,研究结果将为短蛸的人工繁育、增养殖及放流、种质资源保护工作提供重要参考。一、短蛸cDNA文库构建、微卫星标记开发及引物通用性分析本研究构建的cDNA文库库容为6.9×10~5个独立克隆,重组率达到95%,插入片段的平均长度大于1000bp。通过筛选共获得了3440条高质量的ESTs,拼接得到1803个unigenes。其中450条(25%)unigenes在Gene Ontology系统下分为33类,通过比对KEGG数据库将576个(31.9%)unigenes归入153个基因或可能参与的代谢途径,275个(15.3%)unigenes归为22个COG类别。从获得的ESTs中开发了119个多态性微卫星标记,每个位点的有效等位基因数为1.343~13.954个;观测杂合度(Ho)为0.000~1.0000,平均观测杂合度为0.575;期望杂合度(He)为0.260~0.902,平均期望杂合度为0.706;多态信息含量(PIC)为0.304~0.923。在所有位点中,高度多态性位点(PIC0.5)有109个,中度多态性位点(0.5PIC0.25)有10个;连锁不平衡检测结果显示,位点间无连锁不平衡现象;经Bonferroni校正后,有22个位点显著偏离哈迪-温伯格平衡。此外,分析了43对引物在近缘种金乌贼(Sepia esculenta)、长蛸(Octopus minor)、真蛸(Octopus vulgaris)、卵蛸(Amphioctopus ovulum)、日本无针乌贼(Sepiella japonica)中的通用性情况,结果显示在金乌贼、长蛸、真蛸、卵蛸和日本无针乌贼中分别有5个、8个、7个、2个和1个微卫星标记成功扩增,表明这些位点的通用性较低,近缘物种的微卫星引物有待进一步开发。本研究开发的短蛸微卫星标记将为其种群遗传结构研究提供重要工具,有助于其种质资源保护与管理。二、短蛸微卫星多重PCR体系的构建及交配模式分析本研究选取12对高多态性微卫星标记进行优化组合,构建了4组三重PCR体系,对短蛸4个母本、104个子代及19个候选父本进行亲权鉴定,分析其交配模式。结果表明,构建的4组三重PCR体系可有效鉴定短蛸的亲权关系,104个子代鉴定率为94.23%;♀1组样品鉴定出12个子代,父本数为3个,♀2组样品鉴定出40个子代,父本数为7个,♀3组样品鉴定出19个子代,父本数为2个,♀4组样品鉴定出27个子代,父本数为4个;并且父本♂2,♂3,♂7和♂10均与两个以上的母本发生了交配,由此分析得出短蛸交配模式存在多雌多雄关系。多雌多雄交配模式是水产动物对环境及人为捕捞压力的一种适应,能有效提高等位基因遗传多样性以及子代遗传变异类型,对稳定其种群结构,提高繁殖效率和子代质量起到积极作用。交配模式研究可为短蛸的人工繁育及种质资源保护提供重要的基础资料。三、短蛸交配前后性选择机制研究本研究首先选取36个成体短蛸进行形态测量并分析11个形态参数的相关性,结果发现短蛸的胴长、胴宽、8个腕长与总重有显著相关性。选取14个多态性微卫星标记对3个母本、176个子代及17个候选父本进行亲权鉴定,证明短蛸存在多雌多雄交配模式。对有子代和无子代父本的形态参数进行T检验,未发现显著性差异(P0.05),表明短蛸雌性个体在交配前未对雄性交配对象的外部特征进行选择。对后代比例高的父本与后代比例低的父本的形态参数进行T检验,发现父权比例与父本的形态大小参数无关;对后代比例高和后代比例低的父本与母本的遗传相似性进行计算,发现父权比例与父母本遗传相似性有关联性,父母本遗传相似性越高,后代比例越高。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

与 NCBI 非冗余蛋白质 Nr 数据库或 COG（蛋白质）数据库比对来预测编码蛋白的序列，比对标准可以设定为 1e2 Go 软件在 Gene Ontology 系统下对获得的序列作功能注释[100]。A，mRNA，cDNA 文库的质量评估总 RNA 和 mRNA 经琼脂糖凝胶电泳，结果如图 2-1。图 2-1A 显8S rRNA 的目的条带清晰，说明总 RNA 完整性很好。图 2-1B 显NA 呈弥散状分布，其片段大小在 650bp 到 4000 bp，说明 mRN于后续 cDNA 文库的构建。插入片段部分电泳结果如图 2 所示拖尾，片段大小在 1000bp 以上。根据 Clareke-Carbon 公式计算少含有 1.7×105个克隆[101]。重组率达 80%以上才算文库构建成 cDNA 文库库容为 6.9×105个独立克隆，重组率达到 95%（38均一化全长 cDNA 文库质量良好，可用于后续的测序分析。

图 2-2 短蛸 cDNA 文库插入片段的 PCR 扩增结果M，分子标记；1-16，插入片段。Fig. 2-2 PCR detection of the inserts of A. fangsiao cDNAlibrary.M, molecular marker; 1–16, inserts. 基因片段的整合与功能注释通过筛选获得了 3440 条 ESTs，拼接得到 1803 个 unigenes，长度分布如图，其平均长度为 688bp。这些 unigenes 中有 1622 条（占总 unigenes 的 90%到开放阅读框，平均长度为 359bp；与 NCBI 非冗余蛋白质 Nr 数据库ss-Port 蛋白数据库比对分别有 684 条 (37.9%)，508 条 (28.2%)unigenes 与公列有较高的同源性。使用 Blast N 和 Blast X 两个程序在 GO（Gene Ontology）系统上对聚类的 E注释，注释到 450 条（25%）unigenes 归入 3 个本体（图 2-4）。在 GO 系细胞成分、分子功能和生物学过程三类，三大本体中分别有 721 条（占 38.1% 条（34.6%）和 518 条（27.3%）已公布的序列。根据构成的细胞成分，短蛸织的 unigenes 可分为 8 类，其中细胞和细胞组成部分数量最多(194, 29.6%

图 2-3 拼接片段 unigenes 的长度分布图Fig. 2-3 Length distribution of unigenes.O（Gene Ontology）系统上功能注释结果：450 个 unigen体：生物过程, 细胞组分和分子功能
【参考文献】

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本文编号：2882233