对虾β抑制蛋白对Toll和Jak/Stat信号通路的调控及纤维蛋白原相关蛋白在对虾抗细菌免疫中的功能研究
发布时间：2020-12-25 11:30
脊椎动物的免疫系统由先天免疫和适应免疫组成,无脊椎动物缺乏特有的适应性免疫,主要依靠先天免疫抵御病原微生物的入侵。有关果蝇的先天免疫研究的比较深入,发现了果蝇中存在三条主要的免疫相关信号通路,Toll、IMD和Jak/Stat信号通路,有关这三条信号通路的调控也有相关报道。在其他无脊椎动物如对虾中,也存在类似的信号通路,但是关于这些信号通路调控的研究报道却很少。本论文主要研究了对虾中Toll和Jak/Stat信号通路的调控;另外还对感知和识别病原的模式识别受体纤维蛋白原相关蛋白在抗细菌免疫中的功能开展了研究。1.β抑制蛋白通过调控Dorsal的核移位和转录活性来负性调控Toll信号通路Toll信号通路在果蝇和哺乳动物先天免疫中起着非常重要的作用。Toll信号通路的激活和抑制在这些生物中受到精细的调控。尽管已经在对虾中发现了 Toll信号通路的一些关键的分子元件,但是关于这条信号通路的功能和调控研究的很少。为了研究β抑制蛋白（β-arrestins）对Toll信号通路的调控,我们首先利用Staphylocaccus aureus刺激对虾,检测Toll信号通路转录因子Dorsal的核移位变...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 无脊椎动物先天免疫研究进展
1. 无脊椎动物的Toll信号通路
2. 无脊椎动物的IMD信号通路
3. 无脊椎动物的Jak/Stat信号通路
4.抑制蛋白arrestins对调控信号通路机制的研究
5. 无脊椎动物PRRs中的FREPs
6. 本论文研究的目的,结果及意义
第二章 在对虾中,β-arrestin通过调控Dorsal的转位和转录活性来负性调控Toll信号通路
一、前言
二、材料和方法
1. 试剂和仪器
2. 细菌刺激和样品的收集
3. cDNA的克隆和序列分析
4. 组织的提取和半定量RT-PCR水平和western blot水平的表达模式
5. 重组蛋白的表达和抗体的制备
6. 荧光实时定量PCR反转得到的cDNA
7. RNAi实验
8. 核质提取的实验
9. 细菌清除和存活率的实验
10. Pull-down实验
11. 免疫细胞化学实验
12. 免疫共沉淀
13. PD98059抑制剂实验
三、结果
1. 在S. aureus刺激后Toll信号通路被激活并在对虾抗细菌免疫中起着关键的作用
2. βArr1,βarr2和ERK参与了Toll信号通路的调控
3. βArrs和Cactus作用形成βarr-Cactus-Dorsal三聚体
4. βArrs的N-terminal结构域与Cactus的PEST结构域具有相互作用
5. 用GST-binding柱料和His-binding柱料来做pull down实验
6. Cactus的ANK结构域和Dorsal的RHD结构域作用及βarrs,Cactus和Dorsal形成复合物
7. βArrs和非磷酸化的ERK相互作用抑制ERK的磷酸化
8. βArrs的C-terminus与ERK作用
9. ERK影响细胞核中Dorsal的磷酸化水平
四、讨论
第三章 β-Arrestin 1与TC45作用使Stat去磷酸化进而抑制抗菌肽的表达
一、前言
二、材料和方法
1. 试剂和仪器
2. 组织分布
3. 分子克隆和序列分析
4. 重组表达和抗体制备
5. RNAi实验
6. 细菌的清除和死亡率实验
7. Western blotting分析
8. 免疫细胞化学实验
9. 免疫共沉淀
10. 抑制剂实验
11. Pull-down实验
12. 干扰掉Stat,βarr1和TC45再用形V.anguillarum刺激检测AMPs的变化
13. βArr1和TC45过表达
三、结果
1. 对虾中βarrs,TC45和Stat的组织分布
2. Stat参与了对虾抗细菌免疫
3. 干扰掉βarr1和TC45后Stat的磷酸化水平升高
4. βArr1和TC45通过使活化的Stat的去磷酸化负性调控了Stat的抗细菌免疫
5. βArr1,TC45和Stat三者之间能发生相互作用
6. βArr1的C-terminal结构域和Stat的Link结构域作用
599-800,βarrl的C-terminal结构域作用"> 7. TC45分别与Stat599-800,βarrl的C-terminal结构域作用
8. βArr1和TC45影响Stat所调控的AMPs的表达
四、讨论
第四章 一种纤维蛋白原相关蛋白参与对虾的抗细菌免疫
一、引言
二、材料和方法
1. 试剂和仪器
2. 病原免疫刺激和组织样提取
3. RNA的提取和cDNA的合成
4. MjFREP2全长的克隆
5. 序列BLAST分析和相似性比较
6. MjFREP2蛋白的表达和纯化及抗体的制备
7. 半定量PCR和荧光定量PCR
8. Western blot分析
9. 细菌凝集实验
10. 细菌结合实验
11. 酶联免疫反应实验（ELISA）
12. 免疫细胞化学实验
13. 细菌清除实验
14. 荧光标记细菌和吞噬实验
15. RNAi实验
16. 对虾死亡率实验
三、结果
1. MjFREP2基因克隆和序列分析
2. MjFREP2广泛分布各个组织中及受到细菌刺激之后上调表达
3. MjFREP2在钙离子存在下能够凝集细菌
4. MjFREP2通过结合多糖结合到细菌的表面
5. MjFREP2被血细胞分泌出去并结合到血淋巴中的细菌上
6. 在对虾体内,MjFREP2促进了细菌的清除
7. MjFREP2促进了对虾血细胞的吞噬
四、讨论
论文创新点总结
参考文献
致谢
在读期间发表的文章
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：2937562
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
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摘要
ABSTRACT
第一章 无脊椎动物先天免疫研究进展
1. 无脊椎动物的Toll信号通路
2. 无脊椎动物的IMD信号通路
3. 无脊椎动物的Jak/Stat信号通路
4.抑制蛋白arrestins对调控信号通路机制的研究
5. 无脊椎动物PRRs中的FREPs
6. 本论文研究的目的,结果及意义
第二章 在对虾中,β-arrestin通过调控Dorsal的转位和转录活性来负性调控Toll信号通路
一、前言
二、材料和方法
1. 试剂和仪器
2. 细菌刺激和样品的收集
3. cDNA的克隆和序列分析
4. 组织的提取和半定量RT-PCR水平和western blot水平的表达模式
5. 重组蛋白的表达和抗体的制备
6. 荧光实时定量PCR反转得到的cDNA
7. RNAi实验
8. 核质提取的实验
9. 细菌清除和存活率的实验
10. Pull-down实验
11. 免疫细胞化学实验
12. 免疫共沉淀
13. PD98059抑制剂实验
三、结果
1. 在S. aureus刺激后Toll信号通路被激活并在对虾抗细菌免疫中起着关键的作用
2. βArr1,βarr2和ERK参与了Toll信号通路的调控
3. βArrs和Cactus作用形成βarr-Cactus-Dorsal三聚体
4. βArrs的N-terminal结构域与Cactus的PEST结构域具有相互作用
5. 用GST-binding柱料和His-binding柱料来做pull down实验
6. Cactus的ANK结构域和Dorsal的RHD结构域作用及βarrs,Cactus和Dorsal形成复合物
7. βArrs和非磷酸化的ERK相互作用抑制ERK的磷酸化
8. βArrs的C-terminus与ERK作用
9. ERK影响细胞核中Dorsal的磷酸化水平
四、讨论
第三章 β-Arrestin 1与TC45作用使Stat去磷酸化进而抑制抗菌肽的表达
一、前言
二、材料和方法
1. 试剂和仪器
2. 组织分布
3. 分子克隆和序列分析
4. 重组表达和抗体制备
5. RNAi实验
6. 细菌的清除和死亡率实验
7. Western blotting分析
8. 免疫细胞化学实验
9. 免疫共沉淀
10. 抑制剂实验
11. Pull-down实验
12. 干扰掉Stat,βarr1和TC45再用形V.anguillarum刺激检测AMPs的变化
13. βArr1和TC45过表达
三、结果
1. 对虾中βarrs,TC45和Stat的组织分布
2. Stat参与了对虾抗细菌免疫
3. 干扰掉βarr1和TC45后Stat的磷酸化水平升高
4. βArr1和TC45通过使活化的Stat的去磷酸化负性调控了Stat的抗细菌免疫
5. βArr1,TC45和Stat三者之间能发生相互作用
6. βArr1的C-terminal结构域和Stat的Link结构域作用
599-800,βarrl的C-terminal结构域作用"> 7. TC45分别与Stat599-800,βarrl的C-terminal结构域作用
8. βArr1和TC45影响Stat所调控的AMPs的表达
四、讨论
第四章 一种纤维蛋白原相关蛋白参与对虾的抗细菌免疫
一、引言
二、材料和方法
1. 试剂和仪器
2. 病原免疫刺激和组织样提取
3. RNA的提取和cDNA的合成
4. MjFREP2全长的克隆
5. 序列BLAST分析和相似性比较
6. MjFREP2蛋白的表达和纯化及抗体的制备
7. 半定量PCR和荧光定量PCR
8. Western blot分析
9. 细菌凝集实验
10. 细菌结合实验
11. 酶联免疫反应实验（ELISA）
12. 免疫细胞化学实验
13. 细菌清除实验
14. 荧光标记细菌和吞噬实验
15. RNAi实验
16. 对虾死亡率实验
三、结果
1. MjFREP2基因克隆和序列分析
2. MjFREP2广泛分布各个组织中及受到细菌刺激之后上调表达
3. MjFREP2在钙离子存在下能够凝集细菌
4. MjFREP2通过结合多糖结合到细菌的表面
5. MjFREP2被血细胞分泌出去并结合到血淋巴中的细菌上
6. 在对虾体内,MjFREP2促进了细菌的清除
7. MjFREP2促进了对虾血细胞的吞噬
四、讨论
论文创新点总结
参考文献
致谢
在读期间发表的文章
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：2937562
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