MiR-202-5p在牙鲆性腺中的表达与功能分析
发布时间：2021-03-05 09:49
牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国重要的经济海水养殖鱼类之一,其肉质鲜美,蛋白质含量高,具有较高的营养价值,此外,牙鲆的生长速率具有明显的性别差异,单性养殖可以有效地提高经济效益。精巢发育是行有性生殖动物繁殖的基础,而精子发生则是精巢正常发育的关键。精子发生主要指二倍体精原细胞通过减数分裂等一系列复杂的生化反应,进而产生成熟的单倍体精子的过程。尽管我们对精子发生的理解有了长足的进步,相关基因和化学物质的研究也不断被发现和鉴定,但目前,关于牙鲆性腺发育和精子发生的研究多集中于性激素和性别分化相关基因的表达分析方面。此外,性腺发育和精子发生相关基因的研究又多集中于这些编码基因的表达规律和功能分析,对其转录后水平调控研究鲜有报道,而该领域正是目前遗传学研究的热点。本实验室前期通过高通量测序等技术建立了牙鲆精巢和卵巢miRNA文库,并筛选出一批在雌雄性腺中差异表达的miRNA,其中,miR-202-5p是性腺中丰富表达,且雌雄表达差异显著的一个miRNA。在此基础上,本研究采用荧光定量PCR和原位杂交技术构建miR-202-5p在牙鲆不同组织和性腺发育过程中的表达谱。结...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1 牙鲆简介
2 牙鲆性腺及性腺相关基因研究
3 MicroRNA简介
3.1 MicroRNA的合成机制和特征
3.2 MicroRNA的作用机制
3.3 MicroRNA的表达检测方法
4 MicroRNA在水产动物精巢中的作用及研究进展
5 MiR-202-5p在精巢中的研究进展
6 本研究的目的与意义
第一章 MiR-202-5p在牙鲆性腺中的表达分析
1 实验材料
1.1 实验鱼
1.2 试剂
1.3 溶液配制
2 实验方法
2.1 总RNA提取
2.2 荧光定量PCR分析miR-202-5p的组织表达
2.2.1 引物设计
2.2.2 牙鲆各组织及不同时期性腺组织cDNA合成
2.2.3 实时荧光定量PCR
2.3 原位杂交技术分析miR-202-5p在牙鲆性腺中的定位表达
2.3.1 石蜡切片
2.3.2 H.E.染色
2.3.3 PCR扩增vasa非编码区
2.3.4 PCR产物胶回收
2.3.5 TA克隆
2.3.6 转化反应
2.3.7 蓝白斑筛选和测序
2.3.8 质粒提取
2.3.9 体外合成RNA探针
2.3.10 MiR-202-5p反义探针
2.3.11 化学原位杂交
2.3.12 荧光原位杂交
3 实验结果
3.1 总RNA提取
3.2 MiR-202-5p在牙鲆各组织和不同发育时期性腺中的定量表达
3.3 MiR-202-5p在牙鲆精巢、卵巢中的定位表达
4 讨论
第二章 视黄酸与miR-202-5p作用关系研究
1 实验材料与试剂
1.1 实验试剂
1.2 实验试剂
2 实验方法
2.1 视黄酸溶液配制
2.2 视黄酸活体注射
2.3 总RNA提取与反转录
2.4 引物设计
2.5 荧光定量PCR
3 实验结果
3.1 视黄酸与miR-202-5p的作用关系
3.2 视黄酸与精巢发育精子发生相关基因的作用关系
4 讨论
第三章 双荧光素酶报告载体的构建及miRNA靶基因鉴定
1 实验材料
2 实验方法
2.1 MiR-202-5p靶基因预测
2.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR引物设计
2.3 构建重组质粒
2.3.1 RNA提取与反转录
2.3.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR区克隆
2.3.3 转化子菌液质粒小提
2.3.4 双酶切质粒
2.3.5 连接和转化
2.4 靶位点验证
2.4.1 细胞转染
2.4.2 荧光活性检测及数据分析
3 结果
3.1 靶基因的预测及载体构建
3.2 靶基因验证
4 讨论
第四章 在精巢和原代生殖细胞水平miR-202-5p对 ccnd1和cbx2 表达的影响
1 实验材料与试剂
1.1 实验材料
1.2 实验试剂
2 实验方法
2.1 牙鲆精巢组织体外培养
2.2 牙鲆原代生殖细胞培养及纯化
2.3 MiR-202-5p mimics和 antagomir转染
2.3.1 MiR-202-5p mimics和 antagomir转染精巢组织
2.3.2 MiR-202-5p mimics和 antagomir转染原代生殖细胞
2.4 总RNA提取与反转录
2.5 荧光定量PCR
3 结果
3.1 原代生殖细胞纯化
3.2 转染mimics和 antagomir的精巢组织中miR-202-5p的表达
3.3 转染mimics和 antagomir的精巢组织中cbx2和ccnd1 的表达
3.4 转染mimics和 antagomir的原代生殖细胞中miR-202-5p的表达
3.5 转染mimics和 antagomir的原代生殖细胞中cbx2和ccnd1 的表达
4 讨论
小结
参考文献
发表论文
致谢
本文编号：3065001
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1 牙鲆简介
2 牙鲆性腺及性腺相关基因研究
3 MicroRNA简介
3.1 MicroRNA的合成机制和特征
3.2 MicroRNA的作用机制
3.3 MicroRNA的表达检测方法
4 MicroRNA在水产动物精巢中的作用及研究进展
5 MiR-202-5p在精巢中的研究进展
6 本研究的目的与意义
第一章 MiR-202-5p在牙鲆性腺中的表达分析
1 实验材料
1.1 实验鱼
1.2 试剂
1.3 溶液配制
2 实验方法
2.1 总RNA提取
2.2 荧光定量PCR分析miR-202-5p的组织表达
2.2.1 引物设计
2.2.2 牙鲆各组织及不同时期性腺组织cDNA合成
2.2.3 实时荧光定量PCR
2.3 原位杂交技术分析miR-202-5p在牙鲆性腺中的定位表达
2.3.1 石蜡切片
2.3.2 H.E.染色
2.3.3 PCR扩增vasa非编码区
2.3.4 PCR产物胶回收
2.3.5 TA克隆
2.3.6 转化反应
2.3.7 蓝白斑筛选和测序
2.3.8 质粒提取
2.3.9 体外合成RNA探针
2.3.10 MiR-202-5p反义探针
2.3.11 化学原位杂交
2.3.12 荧光原位杂交
3 实验结果
3.1 总RNA提取
3.2 MiR-202-5p在牙鲆各组织和不同发育时期性腺中的定量表达
3.3 MiR-202-5p在牙鲆精巢、卵巢中的定位表达
4 讨论
第二章 视黄酸与miR-202-5p作用关系研究
1 实验材料与试剂
1.1 实验试剂
1.2 实验试剂
2 实验方法
2.1 视黄酸溶液配制
2.2 视黄酸活体注射
2.3 总RNA提取与反转录
2.4 引物设计
2.5 荧光定量PCR
3 实验结果
3.1 视黄酸与miR-202-5p的作用关系
3.2 视黄酸与精巢发育精子发生相关基因的作用关系
4 讨论
第三章 双荧光素酶报告载体的构建及miRNA靶基因鉴定
1 实验材料
2 实验方法
2.1 MiR-202-5p靶基因预测
2.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR引物设计
2.3 构建重组质粒
2.3.1 RNA提取与反转录
2.3.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR区克隆
2.3.3 转化子菌液质粒小提
2.3.4 双酶切质粒
2.3.5 连接和转化
2.4 靶位点验证
2.4.1 细胞转染
2.4.2 荧光活性检测及数据分析
3 结果
3.1 靶基因的预测及载体构建
3.2 靶基因验证
4 讨论
第四章 在精巢和原代生殖细胞水平miR-202-5p对 ccnd1和cbx2 表达的影响
1 实验材料与试剂
1.1 实验材料
1.2 实验试剂
2 实验方法
2.1 牙鲆精巢组织体外培养
2.2 牙鲆原代生殖细胞培养及纯化
2.3 MiR-202-5p mimics和 antagomir转染
2.3.1 MiR-202-5p mimics和 antagomir转染精巢组织
2.3.2 MiR-202-5p mimics和 antagomir转染原代生殖细胞
2.4 总RNA提取与反转录
2.5 荧光定量PCR
3 结果
3.1 原代生殖细胞纯化
3.2 转染mimics和 antagomir的精巢组织中miR-202-5p的表达
3.3 转染mimics和 antagomir的精巢组织中cbx2和ccnd1 的表达
3.4 转染mimics和 antagomir的原代生殖细胞中miR-202-5p的表达
3.5 转染mimics和 antagomir的原代生殖细胞中cbx2和ccnd1 的表达
4 讨论
小结
参考文献
发表论文
致谢
本文编号：3065001
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3065001.html
