凡纳滨对虾免疫相关microRNA的克隆与功能分析
发布时间：2021-03-20 23:07
本论文以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象,运用茎环法克隆了凡纳滨对虾的9个microRNA;通过注射副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）研究9个microRNA的表达情况,根据表达情况,从中筛选了3个表达差异较大的microRNA,即miR-182-5p、miR-184和miR-750;并通过注射microRNA mimics和inhibitor影响3个microRNA（miR-182-5p、miR-184和miR-750）的表达来检测其对细胞凋亡、活性氧含量（ROS）、酯酶等免疫指标的影响。研究结果如下:1.注射副溶血弧菌1.5 h后,let-7a-5p、miR-107、miR-184、miR-184-3p、miR-375、miR-375-3p和miR-750的表达量均出现不同程度的上调,于24 h达到峰值;注射副溶血弧菌3 h后,miR-7和miR-182-5p也开始显著上调,并持续到实验结束。检测miR-182-5p、miR-184和miR-750在不同组织的表达情况,发现miR-182-5p、miR-184和miR-750...
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
microRNA生物合成过程图(Liuetal.,2008)
?2000r离心10min，去掉上清，加入预冷无水乙醇1mL洗涤沉淀，倒去上清液，加入75%预冷无水乙醇1mL洗涤沉淀，倒去上清液，再加入预冷无水乙醇1mL洗涤沉淀，倒去上清液，4℃12000r离心1min，倒置晾干；加入20μLRNasefreeH2O，冰上静置到沉淀溶解（最多5min）。提取的总RNA质量和浓度通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDropND-2000超微量分光光度计进行检测，确保RNA质量和浓度达到PCR扩增标准。2.2.4引物、cDNA合成及PCR扩增根据高通量测序所得microRNA成熟序列，用DNAMAN7.0软件设计PCR扩增所需的microRNA茎环引物（RT引物，图2-1），茎环序列为(5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG–3’)，取microRNA成熟体3’端末端8个碱基的反向互补序列添加到茎环序列3’端，使其3’端暴露出发卡状结构。将设计好的茎环引物送至上海生工生物公司合成，使用RNasefreedH2O稀释至1μM，于-20℃保存备用。图2-1茎环引物结构示意图Fig2-1StructureofLoopprimer检测合格的总RNA利用TAKARA反转录试剂盒（RR047A），按照说明书方案进行cDNA合成，使用表2-1体系配制孵育溶液。PCR仪42℃孵育2min，4℃保存。按照表2-2体系配制反转录溶液。PCR仪37℃孵育15min，85℃5s灭活，-20℃保存。取肝胰脏cDNA原液稀释10倍后进行PCR扩增。PCR扩增体系按照表2-3配制。
凡纳滨对虾免疫相关microRNA的克隆与功能分析12图2-2对虾8个组织的总RNA电泳条带Fig2-2TotalRNAelectrophoresisbandsin8tissuesofshrimp（M:DNAmarkerDS2000,1:眼柄,2:鳃,3:心脏,4:肝胰脏,5:胃,6:肠道,7:肌肉,8:血淋巴）(M:DNAmarkerDS2000,1:eyestalk,2:gill,3:heart,4:hepatopancrease,5:stomach,6:intestine,7:muscle,8:hemocyte)取PCR产物5μL，使用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物长度，结果表明9个microRNA|的PCR产物电泳条带明亮清晰，长度不超过100bp（图2-3），符合预期长度，可以送测。测序结果表明，所选的9个microRNA序列与文库中的序列大致相同，可用于进一步的实验。图2-3PCR产物电泳图Fig2-3PCRproductelectrophoresis（A:实验组，B:空白对照；M:DNAMarkerDS2000,1:let-7a-5p,2:miR-7,3:miR-107,4:miR-182-5p,5:miR-184,6:miR-184-3p,7:miR-375,8:miR-375-3p,9:miR-750,u:u6siRNA）(A:Test，B:Control;M:DNAMarkerDS2000,1:let-7a-5p,2:miR-7,3:miR-107,4:miR-182-5p,5:miR-184,6:184-3p,7:miR-375,8:miR-375-3p,9:miR-750,u:u6siRNA)2.4讨论利用茎环法克隆microRNA具有特异性高、操作简便和成本低廉等特点[64]，
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于FPGA和STM32的流式细胞仪数据采集系统设计[J]. 于丽华,宋树祥,李顺. 计算机测量与控制. 2020(03)
[2]高原肺水肿大鼠肺组织差异表达microRNA的筛选、生物学功能分析及验证[J]. 刘三立,蔡未,刘子泉,侯世科,樊毫军,丁辉. 山东医药. 2020(06)
[3]新型化合物FK106诱导白血病细胞凋亡的作用研究[J]. 李杰,江娟,丁锐,邹远军,郑一敏. 药学研究. 2019(11)
[4]共振瑞利散射法和分光光度法快速测定3种细菌悬液的浓度[J]. 曹凯欣,邱佩佩,贺锦灿,邹志辉,白研,毋福海. 广东药科大学学报. 2019(05)
[5]斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化[J]. 郭欣娅,季策,谢子健,季帆,祖尧,任建峰,张庆华. 上海海洋大学学报. 2020(02)
[6]广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的分离鉴定及其耐药性[J]. 刘杰,曾令泽,贺晓晨,许飘尹,盛雪晴,梁静真,黄钧. 广西畜牧兽医. 2019(05)
[7]2014-2018年浙江省丽水市副溶血弧菌流行情况及菌株特征分析[J]. 陈秀英,梅建华,陈沙彬,柳付明,叶夏良. 疾病监测. 2019(09)
[8]利用LPS诱导胚胎期斑马鱼炎症模型研究羊栖菜多酚抗炎机制[J]. 倪立颖,邹娅雪,付晓婷,段德麟,许加超,高昕. 食品工业科技. 2019(21)
[9]一种针对低浓度应用的高精度微型流式细胞仪[J]. 王丽平,洪陵成,郭天义. 微纳电子技术. 2019(02)
[10]我国凡纳滨对虾种质资源引进与分析[J]. 代平,孔杰,栾生. 科学养鱼. 2018(01)
博士论文
[1]猪睾丸组织发育过程中差异表达基因和microRNA的鉴定及功能研究[D]. 冉茂良.湖南农业大学 2017
[2]玉米自交系苗期冷胁迫miRNA表达谱比较研究[D]. 李世鹏.吉林大学 2016
[3]MiRNA生物合成过程的系统动力学研究[D]. 王霞.西北农林科技大学 2013
[4]细胞内ROS水平改变对细胞活性及相关信号传导途径的影响[D]. 秦勇.浙江大学 2012
[5]Hsa-mir-217在胰腺导管腺癌中的表达及功能的初步验证[D]. 赵武干.北京协和医学院 2010
硕士论文
[1]三唑磷作用下斑马鱼miR-203和miR-217对nup43调控作用的研究[D]. 贾龙略.浙江理工大学 2017
[2]一种血清外泌体分离方法的构建及其在乳腺癌microRNA检测方面的应用[D]. 渠香云.上海交通大学 2016
[3]基于流式原理的细菌测量方法及食品中致病菌标准物质制备技术研究[D]. 薛蕾.山西农业大学 2015
[4]中华绒螯蟹miRNA的分离及在卵母细胞成熟过程中的表达分析[D]. 史莉莉.上海海洋大学 2012
[5]复合免疫增强剂对凡纳滨对虾生长、存活及非特异性免疫力的影响[D]. 刘倩.中国海洋大学 2010
[6]MicroRNA重要位点的信息熵分析和高粱microRNA及其靶基因预测[D]. 杜江峰.西北农林科技大学 2009
本文编号：3091836
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
microRNA生物合成过程图(Liuetal.,2008)
?2000r离心10min，去掉上清，加入预冷无水乙醇1mL洗涤沉淀，倒去上清液，加入75%预冷无水乙醇1mL洗涤沉淀，倒去上清液，再加入预冷无水乙醇1mL洗涤沉淀，倒去上清液，4℃12000r离心1min，倒置晾干；加入20μLRNasefreeH2O，冰上静置到沉淀溶解（最多5min）。提取的总RNA质量和浓度通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDropND-2000超微量分光光度计进行检测，确保RNA质量和浓度达到PCR扩增标准。2.2.4引物、cDNA合成及PCR扩增根据高通量测序所得microRNA成熟序列，用DNAMAN7.0软件设计PCR扩增所需的microRNA茎环引物（RT引物，图2-1），茎环序列为(5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG–3’)，取microRNA成熟体3’端末端8个碱基的反向互补序列添加到茎环序列3’端，使其3’端暴露出发卡状结构。将设计好的茎环引物送至上海生工生物公司合成，使用RNasefreedH2O稀释至1μM，于-20℃保存备用。图2-1茎环引物结构示意图Fig2-1StructureofLoopprimer检测合格的总RNA利用TAKARA反转录试剂盒（RR047A），按照说明书方案进行cDNA合成，使用表2-1体系配制孵育溶液。PCR仪42℃孵育2min，4℃保存。按照表2-2体系配制反转录溶液。PCR仪37℃孵育15min，85℃5s灭活，-20℃保存。取肝胰脏cDNA原液稀释10倍后进行PCR扩增。PCR扩增体系按照表2-3配制。
凡纳滨对虾免疫相关microRNA的克隆与功能分析12图2-2对虾8个组织的总RNA电泳条带Fig2-2TotalRNAelectrophoresisbandsin8tissuesofshrimp（M:DNAmarkerDS2000,1:眼柄,2:鳃,3:心脏,4:肝胰脏,5:胃,6:肠道,7:肌肉,8:血淋巴）(M:DNAmarkerDS2000,1:eyestalk,2:gill,3:heart,4:hepatopancrease,5:stomach,6:intestine,7:muscle,8:hemocyte)取PCR产物5μL，使用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物长度，结果表明9个microRNA|的PCR产物电泳条带明亮清晰，长度不超过100bp（图2-3），符合预期长度，可以送测。测序结果表明，所选的9个microRNA序列与文库中的序列大致相同，可用于进一步的实验。图2-3PCR产物电泳图Fig2-3PCRproductelectrophoresis（A:实验组，B:空白对照；M:DNAMarkerDS2000,1:let-7a-5p,2:miR-7,3:miR-107,4:miR-182-5p,5:miR-184,6:miR-184-3p,7:miR-375,8:miR-375-3p,9:miR-750,u:u6siRNA）(A:Test，B:Control;M:DNAMarkerDS2000,1:let-7a-5p,2:miR-7,3:miR-107,4:miR-182-5p,5:miR-184,6:184-3p,7:miR-375,8:miR-375-3p,9:miR-750,u:u6siRNA)2.4讨论利用茎环法克隆microRNA具有特异性高、操作简便和成本低廉等特点[64]，
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于FPGA和STM32的流式细胞仪数据采集系统设计[J]. 于丽华,宋树祥,李顺. 计算机测量与控制. 2020(03)
[2]高原肺水肿大鼠肺组织差异表达microRNA的筛选、生物学功能分析及验证[J]. 刘三立,蔡未,刘子泉,侯世科,樊毫军,丁辉. 山东医药. 2020(06)
[3]新型化合物FK106诱导白血病细胞凋亡的作用研究[J]. 李杰,江娟,丁锐,邹远军,郑一敏. 药学研究. 2019(11)
[4]共振瑞利散射法和分光光度法快速测定3种细菌悬液的浓度[J]. 曹凯欣,邱佩佩,贺锦灿,邹志辉,白研,毋福海. 广东药科大学学报. 2019(05)
[5]斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化[J]. 郭欣娅,季策,谢子健,季帆,祖尧,任建峰,张庆华. 上海海洋大学学报. 2020(02)
[6]广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的分离鉴定及其耐药性[J]. 刘杰,曾令泽,贺晓晨,许飘尹,盛雪晴,梁静真,黄钧. 广西畜牧兽医. 2019(05)
[7]2014-2018年浙江省丽水市副溶血弧菌流行情况及菌株特征分析[J]. 陈秀英,梅建华,陈沙彬,柳付明,叶夏良. 疾病监测. 2019(09)
[8]利用LPS诱导胚胎期斑马鱼炎症模型研究羊栖菜多酚抗炎机制[J]. 倪立颖,邹娅雪,付晓婷,段德麟,许加超,高昕. 食品工业科技. 2019(21)
[9]一种针对低浓度应用的高精度微型流式细胞仪[J]. 王丽平,洪陵成,郭天义. 微纳电子技术. 2019(02)
[10]我国凡纳滨对虾种质资源引进与分析[J]. 代平,孔杰,栾生. 科学养鱼. 2018(01)
博士论文
[1]猪睾丸组织发育过程中差异表达基因和microRNA的鉴定及功能研究[D]. 冉茂良.湖南农业大学 2017
[2]玉米自交系苗期冷胁迫miRNA表达谱比较研究[D]. 李世鹏.吉林大学 2016
[3]MiRNA生物合成过程的系统动力学研究[D]. 王霞.西北农林科技大学 2013
[4]细胞内ROS水平改变对细胞活性及相关信号传导途径的影响[D]. 秦勇.浙江大学 2012
[5]Hsa-mir-217在胰腺导管腺癌中的表达及功能的初步验证[D]. 赵武干.北京协和医学院 2010
硕士论文
[1]三唑磷作用下斑马鱼miR-203和miR-217对nup43调控作用的研究[D]. 贾龙略.浙江理工大学 2017
[2]一种血清外泌体分离方法的构建及其在乳腺癌microRNA检测方面的应用[D]. 渠香云.上海交通大学 2016
[3]基于流式原理的细菌测量方法及食品中致病菌标准物质制备技术研究[D]. 薛蕾.山西农业大学 2015
[4]中华绒螯蟹miRNA的分离及在卵母细胞成熟过程中的表达分析[D]. 史莉莉.上海海洋大学 2012
[5]复合免疫增强剂对凡纳滨对虾生长、存活及非特异性免疫力的影响[D]. 刘倩.中国海洋大学 2010
[6]MicroRNA重要位点的信息熵分析和高粱microRNA及其靶基因预测[D]. 杜江峰.西北农林科技大学 2009
本文编号：3091836
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