EPC抗氧化应激通路Nrf2/ARE对鲤春病毒的响应
发布时间：2023-03-19 12:21
越来越多的研究表明,由病毒感染诱导的氧化应激所导致的组织损伤,是病毒重要的致病机制之一。而核因子E2相关因子2(Nuclear factor-E2related factor2, Nrf2)是机体在应对氧化刺激时,启动细胞防御体系的关键调控因子。由Nrf2/ARE信号转导通路介导的下游效应基因在细胞解毒,抗氧化、抗炎症、抗凋亡等方面发挥着重要作用；同时,也可能影响病毒的入侵、复制、组装、释放等过程。因此,有必要深入探讨Nrf2与病毒的相互作用,以便为病毒性疾病的预防和治疗提供新的解决策略。 本研究以黑头软口鲦上皮瘤细胞(Epithelioma Papulosum Cyprini, EPC)为实验材料,克隆得到黑头软口鲦(Pimephales promelas) Nrf2基因的全长cDNA。以此为基础,在细胞水平上,探讨了鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染对核转录因子Nrf2转录和表达的影响以及Nrf2的激活对SVCV复制水平的影响。主要结论如下： 1.黑头软口鲦Nrf2基因cDNA的克隆及系统进化分析 利用反转录-PCR及3’/5’-RACE技术从EPC细胞中克隆得到了黑头软口鲦Nrf2...
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1 Nrf2与Nrf2/ARE信号转导通路
1.1 核转录因子Nrf2
1.2 Nrf2的Keap1依赖型调控方式
1.3 Nrf2的Keap1非依赖型调控方式
1.4 Nrf2/ARE防御通路中的效应基因
2 Nrf2与病毒相关性研究
2.1 病毒感染诱导的氧化应激
2.2 病毒感染对Nrf2表达的影响
2.3 Nrf2的表达对病毒感染的影响
3 Nrf2的小分子激活剂
4 抗氧化策略在抗病毒感染中的应用
5 本研究的目的与意义
第二章 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA克隆与系统进化分析
1 材料与方法
1.1 细胞、菌株和载体
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 EPC细胞复苏及传代培养
1.5 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA核心片段的克隆
1.5.1 引物设计
1.5.2 EPC细胞总RNA提取
1.5.3 第一链cDNA的合成
1.5.4 巢式PCR扩增Nrf2基因的核心片段
1.5.5 PCR产物的回收与纯化
1.5.6 大肠杆菌感受态的制备
1.5.7 PCR产物的T载体克隆与测序
1.6 Nrf2基因cDNA 3’末端的克隆
1.6.1 引物设计
1.6.2 3’-RACE扩增Nrf2基因cDNA3’末端
1.6.3 PCR产物的T载体克隆与测序
1.7 Nrf2基因cDNA5’末端的克隆
1.7.1 引物设计
1.7.2 5’-RACE扩增Nrf2基因cDNA 5’末端
1.7.3 PCR产物的T载体克隆与测序
1.8 Nrf2基因序列分析
2 结果与分析
2.1 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA核心片段的克隆和序列测定
2.2 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA 3’-末端的克隆和序列测定
2.3 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA 5’-末端的克隆和序列测定
2.4 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA序列分析
2.5 黑头软口鲦Nrf2的同源性及系统进化分析
3 讨论
4 小结
第三章 SVCV感染与Nrf2表达策略分析
1 材料与方法
1.1 细胞和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 实时荧光定量分析SVCV感染EPC细胞在不同时相下Nrf2的基因表达水平
1.4.1 病毒感染
1.4.2 RNA的提取
1.4.3 反转录
1.4.4 半定量PCR检测SVCV-G mRNA的表达
1.4.5 Real-time PCR检测SVCV感染EPC细胞在不同时相下Nrf2 mRNA的转录情况
1.5 Western blot分析SVCV感染EPC细胞在不同时相下Nrf2的蛋白表达水平
1.5.1 病毒感染
1.5.2 细胞总蛋白的样品制备
1.5.3 细胞核蛋白的样品制备
1.5.4 SDS-PAGE及Western blot分析
2 结果与分析
2.1 半定量PCR检测SVCV-G基因的表达
2.2 SVCV感染上调Nrf2的转录水平
2.3 SVCV感染诱导Nrf2在细胞核内的累积
3 讨论
4 小结
第四章 Nrf2的激活对下游效应基因的调控及对SVCV感染的影响
1 材料与方法
1.1 细胞和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 实验方法
1.4.1 MTT法测定药物毒性
1.4.2 激活剂对Nrf2及其下游效应基因转录和表达的影响
1.4.3 FRAP法测定激活剂处理后的细胞总抗氧化能力
1.4.4 激活剂预处理后的病毒感染及SVCV病毒G基因的定量检测
2 结果与分析
2.1 MTT法测定药物毒性
2.2 激活剂对Nrf2及其下游效应基因转录和表达的影响
2.3 FRAP法测定激活剂处理后的细胞总抗氧化能力
2.4 激活剂预处理后的病毒感染及SVCV病毒G基因的定量检测
3 讨论
4 小结
参考文献
附表Ⅰ：实验中主要试剂的配制方法
附表Ⅱ：硕士期间发表的论文
致谢
本文编号：3765238
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1 Nrf2与Nrf2/ARE信号转导通路
1.1 核转录因子Nrf2
1.2 Nrf2的Keap1依赖型调控方式
1.3 Nrf2的Keap1非依赖型调控方式
1.4 Nrf2/ARE防御通路中的效应基因
2 Nrf2与病毒相关性研究
2.1 病毒感染诱导的氧化应激
2.2 病毒感染对Nrf2表达的影响
2.3 Nrf2的表达对病毒感染的影响
3 Nrf2的小分子激活剂
4 抗氧化策略在抗病毒感染中的应用
5 本研究的目的与意义
第二章 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA克隆与系统进化分析
1 材料与方法
1.1 细胞、菌株和载体
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 EPC细胞复苏及传代培养
1.5 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA核心片段的克隆
1.5.1 引物设计
1.5.2 EPC细胞总RNA提取
1.5.3 第一链cDNA的合成
1.5.4 巢式PCR扩增Nrf2基因的核心片段
1.5.5 PCR产物的回收与纯化
1.5.6 大肠杆菌感受态的制备
1.5.7 PCR产物的T载体克隆与测序
1.6 Nrf2基因cDNA 3’末端的克隆
1.6.1 引物设计
1.6.2 3’-RACE扩增Nrf2基因cDNA3’末端
1.6.3 PCR产物的T载体克隆与测序
1.7 Nrf2基因cDNA5’末端的克隆
1.7.1 引物设计
1.7.2 5’-RACE扩增Nrf2基因cDNA 5’末端
1.7.3 PCR产物的T载体克隆与测序
1.8 Nrf2基因序列分析
2 结果与分析
2.1 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA核心片段的克隆和序列测定
2.2 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA 3’-末端的克隆和序列测定
2.3 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA 5’-末端的克隆和序列测定
2.4 黑头软口鲦Nrf2基因cDNA序列分析
2.5 黑头软口鲦Nrf2的同源性及系统进化分析
3 讨论
4 小结
第三章 SVCV感染与Nrf2表达策略分析
1 材料与方法
1.1 细胞和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 实时荧光定量分析SVCV感染EPC细胞在不同时相下Nrf2的基因表达水平
1.4.1 病毒感染
1.4.2 RNA的提取
1.4.3 反转录
1.4.4 半定量PCR检测SVCV-G mRNA的表达
1.4.5 Real-time PCR检测SVCV感染EPC细胞在不同时相下Nrf2 mRNA的转录情况
1.5 Western blot分析SVCV感染EPC细胞在不同时相下Nrf2的蛋白表达水平
1.5.1 病毒感染
1.5.2 细胞总蛋白的样品制备
1.5.3 细胞核蛋白的样品制备
1.5.4 SDS-PAGE及Western blot分析
2 结果与分析
2.1 半定量PCR检测SVCV-G基因的表达
2.2 SVCV感染上调Nrf2的转录水平
2.3 SVCV感染诱导Nrf2在细胞核内的累积
3 讨论
4 小结
第四章 Nrf2的激活对下游效应基因的调控及对SVCV感染的影响
1 材料与方法
1.1 细胞和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 实验方法
1.4.1 MTT法测定药物毒性
1.4.2 激活剂对Nrf2及其下游效应基因转录和表达的影响
1.4.3 FRAP法测定激活剂处理后的细胞总抗氧化能力
1.4.4 激活剂预处理后的病毒感染及SVCV病毒G基因的定量检测
2 结果与分析
2.1 MTT法测定药物毒性
2.2 激活剂对Nrf2及其下游效应基因转录和表达的影响
2.3 FRAP法测定激活剂处理后的细胞总抗氧化能力
2.4 激活剂预处理后的病毒感染及SVCV病毒G基因的定量检测
3 讨论
4 小结
参考文献
附表Ⅰ：实验中主要试剂的配制方法
附表Ⅱ：硕士期间发表的论文
致谢
本文编号：3765238
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3765238.html
