长牡蛎肿瘤坏死因子（CgTNF-1）免疫调节机制的初步研究

发布时间：2023-04-23 03:30

　　肿瘤坏死因子（TNF）是一种重要的细胞因子，能调节脊椎动物器官发育、组织修复、造血作用以及炎症反应等多个生理过程，并在免疫调节中发挥着重要的作用，目前无脊椎动物肿瘤坏死因子相关研究刚刚起步。本研究选取长牡蛎为研究对象，利用分子生物学、细胞生物学以及生物信息学的相关手段，从长牡蛎基因组中筛选获得一个具有典型TNF结构域的分子（命名为CgTNF-1），对其进行了克隆、原核重组表达以及相关功能的研究。 CgTNF-1分子的ORF全长1014bp，编码337个氨基酸的多肽；预测的蛋白分子量为38.01kDa，等电点（PI）为8.25。其氨基端端具有一个特征性的跨膜结构域，羧基端为典型的TNF结构域，两者通过一段不明确的结构域相连。研究发现CgTNF-1与萨氏海鞘Ciona savignyi中的TNF分子有较高同源性，在进化树分析中被聚类为一支，而与脊椎动物及果蝇肿瘤坏死因子的相似性较低。CgTNF-1mRNA在鳃、性腺、血淋巴、肝胰腺等所有被检测的组织中呈组成型分布，在鳃、心脏、血淋巴和肝胰腺中表达量较高。而CgTNF-1蛋白以可溶型形式定位在牡蛎血淋巴细胞核周围。 发现牡蛎血淋巴细胞中CgT...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
第一章 研究背景
    第一节 细胞因子简介
    第二节 脊椎动物肿瘤坏死因子的发现及相关研究
        一、 肿瘤坏死因子超家族的发现史及研究进展
        二、 肿瘤坏死因子超家族的结构及分类
        三、 肿瘤坏死因子超家族的功能及其与生命活动的密切关系
        四、 肿瘤坏死因子超家族的作用机制
    第三节 无脊椎动物肿瘤坏死因子的研究进展
    第四节 本研究的主要目的及意义
        一、 研究意义
        二、 研究内容
第二章 实验材料与方法
    第一节 实验材料
        一、 实验用动物及相关菌株
        二、 实验用细胞株
        三、 实验用试剂及主要仪器
        四、 实验用引物的主要信息
    第二节 实验方法
        一、 长牡蛎总 RNA 的提取
        二、 cDNA 文库的构建
        三、 目的基因的克隆及测序
        四、 基于双酶切技术构建重组质粒
        五、 基于 His 标签的重组蛋白的可溶性原核表达及纯化
        六、 多克隆抗体的制备及鉴定
        七、 western blotting 分析
        八、 实时荧光定量 PCR
        九、 长牡蛎血淋巴细胞的原代培养
        十、 免疫荧光组化
        十一、LPS 刺激及牡蛎组织材料的收集
        十二、CgTNF-1 免疫剂量确定实验
        十三、LPS 和 CgTNF-1 共刺激实验及血细胞和血淋巴上清的收集
        十四、血淋巴细胞凋亡作用的检测
        十五、血淋巴细胞吞噬作用的检测
        十六、血淋巴上清 NO 含量及免疫相关酶的检测
        十七、血淋巴上清抗菌能力的检测
        十八、ELISA 检测 PAMPs 结合实验
        十九、细胞增殖与毒性检测实验
        二十、实验数据处理
第三章 实验结果
    第一节 CgTNF-1 分子的基本特征
        一、 CgTNF-1 分子的筛选及基本特征
        二、 CgTNF-1 蛋白同源性和进化分析
    第二节 CgTNF-1 的原核可溶性表达和抗体制备
    第三节 CgTNF-1 的组织分布和细胞定位
        一、 CgTNF-1 mRNA 在长牡蛎组织中的分布
        二、 CgTNF-1 在长牡蛎细胞中的定位
    第四节 LPS 刺激后牡蛎血淋巴中 CgTNF-1 基因在转录和翻译水平的时序变化
        一、 LPS 刺激后血淋巴细胞中 CgTNF-1mRNA 表达水平的时序变化
        二、 LPS 刺激后牡蛎血淋巴上清中 CgTNF-1 蛋白表达量的时序变化
    第五节 LPS 和 CgTNF-1 处理对牡蛎血淋巴中相关免疫指标的影响
        一、 CgTNF-1 分子注射剂量的确定
        二、 LPS 和 CgTNF-1 处理后牡蛎血淋巴细胞凋亡和吞噬率的时序变化
        三、 LPS 和 CgTNF-1 处理后牡蛎血淋巴上清中 NO、相关酶活性以及抗菌能力的时序变化
    第六节 CgTNF-1 对细胞增殖的影响
    第七节 CgTNF-1 的 PAMPs 结合活性分析
第四章 分析与讨论
    第一节 牡蛎中肿瘤坏死因子的基本特征及分布
        一、 CgTNF-1 分子的基本特征
        二、 CgTNF-1 在牡蛎组织中的分布以及在血淋巴细胞中的定位
    第二节 免疫刺激能够诱导 CgTNF-1 的表达
    第三节 CgTNF-1 对牡蛎免疫应答反应的调节作用
        一、 CgTNF-1 分子注射剂量的确定
        二、 CgTNF-1 对牡蛎细胞免疫的影响
        三、 CgTNF-1 对牡蛎体液免疫的影响
    第四节 CgTNF-1 对肿瘤细胞的杀伤作用及其 PAMPs 结合能力
第五章 结论
参考文献
作者简历
已发表的论文



本文编号：3798993