青虾RNAi技术的研究及其在蜕皮抑制激素(MIH)基因功能研究中的应用
发布时间：2023-06-01 00:54
青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense),是我国重要的淡水养殖经济虾类。其在分类上属于节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)。近年来,随着青虾遗传育种工作的开展,已有大量与性别和生殖相关的基因被克隆并进行了表达分析,但是对于这些基因的功能研究仍缺少有效的手段。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是一种重要的基因功能研究手段,已在多种甲壳动物功能基因的研究中应用,然而该技术在青虾研究工作中的应用还鲜有报道。在青虾中建立RNAi的方法,将为青虾基因功能的研究开辟一条新的路径。本研究用实验室已克隆的青虾transformer-2(Mntra-2)基因进行青虾RNAi技术的研究,然后将RNAi技术应用到新克隆的青虾蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone, MIH)基因的功能研究中。在Mntra-2基因中研究了RNAi的最佳注射部位、注射剂量以及干扰规律。通过对肌肉、心脏、围心腔和眼柄基部四...
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
第一节 RNA干扰技术简介及其在甲壳动物研究中的应用
1 RNAi的简介
1.1 RNAi的发现
1.2 RNAi的作用机制及特点
1.3 RNAi所需dsRNA或siRNA的合成原则
1.4 RNAi的导入方法
1.4.1 注射法
1.4.2 饲喂法
1.4.3 浸泡法
1.4.4组织培养法
2 RNAi在甲壳动物中的应用
2.1 功能基因的研究
2.2 抗病毒研究
3 RNAi前景展望
第二节 MIH基因和tra-2基因的研究概况
1 MIH基因研究概况
1.1 MIH基因简介
1.2 MIH基因的结构
1.3 MIH基因的作用机理
1.4 MIH基因的功能及研究方法
2 transformer 2(tra-2)基因研究概况
第三节 本研究的目的与意义
第二章 青虾RNAi方法的研究
1 实验材料
1.1 实验用虾
1.2 试剂和仪器
2 dsRNA的准备
2.1 青虾总RNA的提取
2.1.1 实验用品的预处理
2.1.2 总RNA的提取
2.1.3 总RNA的质量检测和浓度测定
2.2 反转录
2.3 制备dsRNA所用引物设计
2.4 开放阅读框片段的扩增
2.5 PCR产物的回收、测序
2.6 dsRNA的合成
2.7 dsRNA的纯化
2.8 dsRNA的质量检测和浓度测定
3 实验方法
3.1 注射部位筛选
3.2 时间依赖性干扰试验
3.3 不同剂量干扰试验
4 RNA提取及荧光定量PCR检测
4.1 RNA的提取
4.2 cDNA第一链的合成
4.3 RT-PCR反应
4.4 Real-time荧光定量PCR分析
5 数据处理
6 实验结果
6.1 最适注射部位筛选结果
6.2 时间依赖性干扰实验结果
6.3 不同剂量干扰效果比较
7 讨论
7.1 注射部位的选择分析
7.2 不同注射剂量的干扰效果的分析
7.3 不同剂量的干扰规律
第三章 RNAi技术在青虾蜕皮抑制激素(MIH)基因功能研究中的应用
第一节 青虾MIH基因全长cDNA的克隆及序列分析
1 实验材料
1.1 实验虾
1.2 主要试剂和仪器
2 实验方法
2.1 青虾眼柄总RNA的提取及反转录
2.2 青虾MIH cDNA基因扩增所用引物设计
2.3 中间片段的扩增
2.4 青虾MIH基因的3'RACE
2.4.1 3'端反转录
2.4.2 3'端扩增
2.5 青虾MIH基因的5'RACE
2.5.1 5'RACE cDNA模板的制备
2.5.2 5'端扩增
2.6 PCR产物的克隆
2.7 序列的测定及分析
3 结果与分析
3.1 青虾眼柄总RNA提取结果
3.2 青虾MIH部分片段、3'端和5'端的分离
3.3 青虾MIH基因全长cDNA序列结构特征
3.4 同源性分析
3.5 系统发育分析
4 讨论
第二节 青虾MIH基因的时空表达分析
1 实验材料
1.1 实验虾
1.2 主要试剂和仪器
2 实验方法
2.1 引物设计及检验
2.2 组织RNA的提取
2.3 cDNA第一链的合成
2.4 RT-PCR反应及分析
3 结果
3.1 青虾各样本总RNA的检测
3.2 MnMIH基因在青虾胚胎发育期、幼体发育期和幼虾发育期的表达
3.3 青虾MIH基因在成体不同组织中的表达
3.4 MnMIH基因在青虾蜕皮周期中表达差异结果
4 讨论
4.1 不同发育时期表达差异
4.2 成体不同组织表达差异
4.3 蜕皮周期表达水平差异
第三节 利用RNAi技术对青虾MIH基因功能的研究
1 材料与方法
1.1 实验虾
1.2 dsRNA的制备
1.3 体外dsRNA的注射
1.4 RNA提取及检测所用试剂和材料
1.5 RT-PCR反应和结果分析
2 结果
2.1 一次性RNAi对基因表达量的影响
2.2 连续性RNAi对青虾蜕皮频次和体重的影响
3 讨论
3.1 RNAi对MIH表达量的影响
3.2 RNAi对青虾蜕皮频次和体重的影响
全文结论
参考文献
附录 实验试剂及配置
致谢
已发表或已接收的论文
本文编号：3826342
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
第一节 RNA干扰技术简介及其在甲壳动物研究中的应用
1 RNAi的简介
1.1 RNAi的发现
1.2 RNAi的作用机制及特点
1.3 RNAi所需dsRNA或siRNA的合成原则
1.4 RNAi的导入方法
1.4.1 注射法
1.4.2 饲喂法
1.4.3 浸泡法
1.4.4组织培养法
2 RNAi在甲壳动物中的应用
2.1 功能基因的研究
2.2 抗病毒研究
3 RNAi前景展望
第二节 MIH基因和tra-2基因的研究概况
1 MIH基因研究概况
1.1 MIH基因简介
1.2 MIH基因的结构
1.3 MIH基因的作用机理
1.4 MIH基因的功能及研究方法
2 transformer 2(tra-2)基因研究概况
第三节 本研究的目的与意义
第二章 青虾RNAi方法的研究
1 实验材料
1.1 实验用虾
1.2 试剂和仪器
2 dsRNA的准备
2.1 青虾总RNA的提取
2.1.1 实验用品的预处理
2.1.2 总RNA的提取
2.1.3 总RNA的质量检测和浓度测定
2.2 反转录
2.3 制备dsRNA所用引物设计
2.4 开放阅读框片段的扩增
2.5 PCR产物的回收、测序
2.6 dsRNA的合成
2.7 dsRNA的纯化
2.8 dsRNA的质量检测和浓度测定
3 实验方法
3.1 注射部位筛选
3.2 时间依赖性干扰试验
3.3 不同剂量干扰试验
4 RNA提取及荧光定量PCR检测
4.1 RNA的提取
4.2 cDNA第一链的合成
4.3 RT-PCR反应
4.4 Real-time荧光定量PCR分析
5 数据处理
6 实验结果
6.1 最适注射部位筛选结果
6.2 时间依赖性干扰实验结果
6.3 不同剂量干扰效果比较
7 讨论
7.1 注射部位的选择分析
7.2 不同注射剂量的干扰效果的分析
7.3 不同剂量的干扰规律
第三章 RNAi技术在青虾蜕皮抑制激素(MIH)基因功能研究中的应用
第一节 青虾MIH基因全长cDNA的克隆及序列分析
1 实验材料
1.1 实验虾
1.2 主要试剂和仪器
2 实验方法
2.1 青虾眼柄总RNA的提取及反转录
2.2 青虾MIH cDNA基因扩增所用引物设计
2.3 中间片段的扩增
2.4 青虾MIH基因的3'RACE
2.4.1 3'端反转录
2.4.2 3'端扩增
2.5 青虾MIH基因的5'RACE
2.5.1 5'RACE cDNA模板的制备
2.5.2 5'端扩增
2.6 PCR产物的克隆
2.7 序列的测定及分析
3 结果与分析
3.1 青虾眼柄总RNA提取结果
3.2 青虾MIH部分片段、3'端和5'端的分离
3.3 青虾MIH基因全长cDNA序列结构特征
3.4 同源性分析
3.5 系统发育分析
4 讨论
第二节 青虾MIH基因的时空表达分析
1 实验材料
1.1 实验虾
1.2 主要试剂和仪器
2 实验方法
2.1 引物设计及检验
2.2 组织RNA的提取
2.3 cDNA第一链的合成
2.4 RT-PCR反应及分析
3 结果
3.1 青虾各样本总RNA的检测
3.2 MnMIH基因在青虾胚胎发育期、幼体发育期和幼虾发育期的表达
3.3 青虾MIH基因在成体不同组织中的表达
3.4 MnMIH基因在青虾蜕皮周期中表达差异结果
4 讨论
4.1 不同发育时期表达差异
4.2 成体不同组织表达差异
4.3 蜕皮周期表达水平差异
第三节 利用RNAi技术对青虾MIH基因功能的研究
1 材料与方法
1.1 实验虾
1.2 dsRNA的制备
1.3 体外dsRNA的注射
1.4 RNA提取及检测所用试剂和材料
1.5 RT-PCR反应和结果分析
2 结果
2.1 一次性RNAi对基因表达量的影响
2.2 连续性RNAi对青虾蜕皮频次和体重的影响
3 讨论
3.1 RNAi对MIH表达量的影响
3.2 RNAi对青虾蜕皮频次和体重的影响
全文结论
参考文献
附录 实验试剂及配置
致谢
已发表或已接收的论文
本文编号：3826342
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