牛蒡子苷元作用鱼类单殖吸虫靶标及机制研究
发布时间：2023-06-23 18:21
单殖吸虫(Monogenean)是一类常见的鱼类寄生虫,广泛分布于世界各地淡、海水水域。常因大量寄生及其引起的继发性疾病感染,造成幼鱼大量死亡,给水产养殖业带来严重的经济损失。指环虫属(Dactylogyrus)和三代虫属(Gyrodactylus)是单殖吸虫纲中物种数目最丰富、也是危害最严重的属。目前,渔业生产中,国标渔药因长期、连年持续增加使用剂量引起寄生虫的耐药性发生,加大了单殖吸虫病防治难度,因此,新药的创制引起水产领域极大的关注。天然产物不仅生物活性丰富而且骨架结构多样,是药物研发的理想来源。前期,本实验室运用活性跟踪法从药用植物中分离鉴定出多种杀灭指环虫的活性小分子,其中牛蒡子苷元(Arctigenin,ARG)杀虫效果显著、对鱼类毒性低,是理想的开发成为专用杀虫渔药的先导化合物。然而,缺乏对先导化合物作用靶点和机制的研究将限制先导化合物的进一步结构优化,阻碍药物的研发进程。本研究首先构建小林三代虫(Gyrodactylus kobayashii)感染金鱼实验模型,在此基础上,通过ARG作用小林三代虫形态学、RNA-seq转录组学和iTRAQ定量蛋白组学以及利用金纳米探针分...
【文章页数】：181 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 三代虫简介
1.1.1 三代虫形态结构
1.1.2 三代虫分类学
1.1.3 三代虫感染宿主免疫反应
1.1.4 三代虫的危害以及防治策略
1.2 牛蒡子苷元研究进展
1.2.1 杀虫作用
1.2.2 抗炎作用
1.2.3 调节心血管系统
1.2.4 降血糖
1.2.5 抗肿瘤作用
1.2.6 其他生物活性
1.3 小分子化合物靶点鉴定方法概述
1.3.1 转录组学在药物靶点鉴定中的应用
1.3.2 蛋白组学在靶点鉴定中的应用
1.3.3 直接靶点鉴定方法
1.4 金纳米颗粒概述
1.4.1 金纳米粒子的制备
1.4.2 金纳米粒子表面修饰
1.4.3 金纳米粒子在药物靶点鉴定中的应用
1.5 选题目的和意义
第二章 小林三代虫感染金鱼实验模型的建立
2.1 材料与方法
2.1.1 动物和药品
2.1.2 试剂和仪器
2.1.3 无虫金鱼的获得
2.1.4 小林三代虫纯化培养
2.1.5 三代虫的种类鉴定
2.1.6 小林三代虫保种
2.1.7 酶切法快速鉴定金鱼三代虫种类
2.1.8 金鱼对小林三代虫感染的免疫应答
2.2 结果与分析
2.2.1 寄生金鱼三代虫种类
2.2.2 小林三代虫形态学鉴定结果
2.2.3 小林三代虫分子生物学鉴定结果
2.2.4 酶切法鉴定小林三代虫-金鱼模型纯化结果
2.2.5 金鱼对小林三代虫感染的免疫应答
2.3 讨论
2.3.1 小林三代虫是自然感染金鱼优势种类
2.3.2 小林三代虫感染金鱼实验模型可稳定传代
2.3.3 细胞因子的表达与清除三代虫感染有关
2.4 小结
第三章 牛蒡子苷元安全性评价及作用小林三代虫形态学研究
3.1 材料与方法
3.1.1 试验动物
3.1.2 试验药品
3.1.3 试剂和仪器
3.1.4 杀虫活性评价
3.1.5 金鱼安全性评价
3.1.6 ARG对三代虫活动能力的影响
3.1.7 ARG对三代虫超微结构的影响
3.1.8 ARG对三代虫肌肉结构的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 ARG杀虫活性
3.2.2 ARG对金鱼的安全性评价结果
3.2.3 ARG处理后三代虫作用症状
3.2.4 三代虫表皮超微结构变化
3.2.5 三代虫内部超微结构变化
3.2.6 肌肉结构损伤结果
3.3 讨论
3.3.1 ARG显示较低的毒性
3.3.2 ARG显示新颖的杀灭三代虫机制
3.3.3 ARG杀虫机制与表皮破坏和呼吸抑制有关
3.4 小结
第四章 牛蒡子苷元对小林三代虫转录组水平的影响
4.1 材料与方法
4.1.1 供试动物
4.1.2 试验药品
4.1.3 试剂和仪器
4.1.4 小林三代虫的培养
4.1.5 ARG药浴三代虫的收集
4.1.6 总RNA提取及定量
4.1.7 cDNA文库的构建、质量检测及测序
4.1.8 测序数据组装和注释
4.1.9 基因差异表达分析
4.1.10 GO和 KEGG网络富集分析
4.1.11 qRT-PCR验证
4.2 结果与分析
4.2.1 ARG药浴的三代虫活动能力和存活率统计结果
4.2.2 总RNA质量检测
4.2.3 测序结果统计
4.2.4 转录本拼接统计
4.2.5 基因功能注释
4.2.6 基因差异表达分析
4.2.7 差异表达基因GO富集分析
4.2.8 差异表达基因KEGG富集分析
4.2.9 差异表达基因韦恩图分析
4.2.10 qRT-PCR验证结果
4.3 讨论
4.3.1 三代虫来源的RNA筛选方法可靠
4.3.2 转录组测序获得大量三代虫基因信息
4.3.3 ARG杀虫作用于体壁结构破坏有关
4.3.4 ARG药浴引起三代虫能量代谢紊乱
4.4 小结
第五章 牛蒡子苷元作用小林三代虫蛋白质组比较研究
5.1 材料与方法
5.1.1 供试动物
5.1.2 试剂和仪器
5.1.3 主要试剂配制
5.1.4 ARG药浴三代虫的收集
5.1.5 iTRAQ蛋白定量
5.1.6 蛋白质定量和差异蛋白GO、KEGG通路富集分析
5.1.7 转录组和蛋白质组关联分析
5.1.8 qRT-PCR分析
5.1.9 ATP含量检测
5.2 结果与分析
5.2.1 蛋白质量检测结果
5.2.2 蛋白质鉴定信息
5.2.3 蛋白质COG功能注释
5.2.4 差异表达蛋白鉴定与分析
5.2.5 蛋白质组与转录组关联分析
5.2.6 ARG对三代虫ATP酶以及呼吸链复合物基因表达的影响
5.2.7 ARG对小林三代虫ATP含量的影响
5.3 讨论
5.3.1 iTRAQ技术为研究ARG的杀虫机制奠定基础
5.3.2 ARG作用下小林三代虫差异蛋白分析
5.4 小结
第六章 利用金纳米探针鉴定牛蒡子苷元作用小林三代虫靶点
6.1 材料与方法
6.1.1 供试动物
6.1.2 试剂与仪器
6.1.3 化合物2 的合成与杀虫活性评价
6.1.4 化合物6和10 的设计与合成
6.1.5 金纳米探针GNP-6和GNP-10 的合成
6.1.6 金纳米探针透射电镜观察
6.1.7 傅立叶变换红外光谱检测
6.1.8 HPLC-MS/MS定量配体
6.1.9 金纳米探针虫体摄取的电镜观察
6.1.10 金纳米探针离体杀虫活性评价
6.1.11 小林三代虫裂解液的准备
6.1.12 靶点蛋白的鉴定
6.2 结果与分析
6.2.1 化合物1-10 的结构表征
6.2.2 化合物2 在体作用小林三代虫活性
6.2.3 金纳米探针形貌观察和粒径分布
6.2.4 金纳米探针傅里叶变换红外光谱检测
6.2.5 金纳米探针的表面配体定量
6.2.6 金纳米探针虫体定位研究及杀虫活性评价
6.2.7 化合物1 的靶点鉴定
6.3 讨论
6.3.1 MyosinⅡ是ARG作用小林三代虫直接靶点
6.3.2 肌球蛋白是一类重要的药物驱虫靶点
6.4 小结
第七章 结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
本文编号：3835071
【文章页数】：181 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 三代虫简介
1.1.1 三代虫形态结构
1.1.2 三代虫分类学
1.1.3 三代虫感染宿主免疫反应
1.1.4 三代虫的危害以及防治策略
1.2 牛蒡子苷元研究进展
1.2.1 杀虫作用
1.2.2 抗炎作用
1.2.3 调节心血管系统
1.2.4 降血糖
1.2.5 抗肿瘤作用
1.2.6 其他生物活性
1.3 小分子化合物靶点鉴定方法概述
1.3.1 转录组学在药物靶点鉴定中的应用
1.3.2 蛋白组学在靶点鉴定中的应用
1.3.3 直接靶点鉴定方法
1.4 金纳米颗粒概述
1.4.1 金纳米粒子的制备
1.4.2 金纳米粒子表面修饰
1.4.3 金纳米粒子在药物靶点鉴定中的应用
1.5 选题目的和意义
第二章 小林三代虫感染金鱼实验模型的建立
2.1 材料与方法
2.1.1 动物和药品
2.1.2 试剂和仪器
2.1.3 无虫金鱼的获得
2.1.4 小林三代虫纯化培养
2.1.5 三代虫的种类鉴定
2.1.6 小林三代虫保种
2.1.7 酶切法快速鉴定金鱼三代虫种类
2.1.8 金鱼对小林三代虫感染的免疫应答
2.2 结果与分析
2.2.1 寄生金鱼三代虫种类
2.2.2 小林三代虫形态学鉴定结果
2.2.3 小林三代虫分子生物学鉴定结果
2.2.4 酶切法鉴定小林三代虫-金鱼模型纯化结果
2.2.5 金鱼对小林三代虫感染的免疫应答
2.3 讨论
2.3.1 小林三代虫是自然感染金鱼优势种类
2.3.2 小林三代虫感染金鱼实验模型可稳定传代
2.3.3 细胞因子的表达与清除三代虫感染有关
2.4 小结
第三章 牛蒡子苷元安全性评价及作用小林三代虫形态学研究
3.1 材料与方法
3.1.1 试验动物
3.1.2 试验药品
3.1.3 试剂和仪器
3.1.4 杀虫活性评价
3.1.5 金鱼安全性评价
3.1.6 ARG对三代虫活动能力的影响
3.1.7 ARG对三代虫超微结构的影响
3.1.8 ARG对三代虫肌肉结构的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 ARG杀虫活性
3.2.2 ARG对金鱼的安全性评价结果
3.2.3 ARG处理后三代虫作用症状
3.2.4 三代虫表皮超微结构变化
3.2.5 三代虫内部超微结构变化
3.2.6 肌肉结构损伤结果
3.3 讨论
3.3.1 ARG显示较低的毒性
3.3.2 ARG显示新颖的杀灭三代虫机制
3.3.3 ARG杀虫机制与表皮破坏和呼吸抑制有关
3.4 小结
第四章 牛蒡子苷元对小林三代虫转录组水平的影响
4.1 材料与方法
4.1.1 供试动物
4.1.2 试验药品
4.1.3 试剂和仪器
4.1.4 小林三代虫的培养
4.1.5 ARG药浴三代虫的收集
4.1.6 总RNA提取及定量
4.1.7 cDNA文库的构建、质量检测及测序
4.1.8 测序数据组装和注释
4.1.9 基因差异表达分析
4.1.10 GO和 KEGG网络富集分析
4.1.11 qRT-PCR验证
4.2 结果与分析
4.2.1 ARG药浴的三代虫活动能力和存活率统计结果
4.2.2 总RNA质量检测
4.2.3 测序结果统计
4.2.4 转录本拼接统计
4.2.5 基因功能注释
4.2.6 基因差异表达分析
4.2.7 差异表达基因GO富集分析
4.2.8 差异表达基因KEGG富集分析
4.2.9 差异表达基因韦恩图分析
4.2.10 qRT-PCR验证结果
4.3 讨论
4.3.1 三代虫来源的RNA筛选方法可靠
4.3.2 转录组测序获得大量三代虫基因信息
4.3.3 ARG杀虫作用于体壁结构破坏有关
4.3.4 ARG药浴引起三代虫能量代谢紊乱
4.4 小结
第五章 牛蒡子苷元作用小林三代虫蛋白质组比较研究
5.1 材料与方法
5.1.1 供试动物
5.1.2 试剂和仪器
5.1.3 主要试剂配制
5.1.4 ARG药浴三代虫的收集
5.1.5 iTRAQ蛋白定量
5.1.6 蛋白质定量和差异蛋白GO、KEGG通路富集分析
5.1.7 转录组和蛋白质组关联分析
5.1.8 qRT-PCR分析
5.1.9 ATP含量检测
5.2 结果与分析
5.2.1 蛋白质量检测结果
5.2.2 蛋白质鉴定信息
5.2.3 蛋白质COG功能注释
5.2.4 差异表达蛋白鉴定与分析
5.2.5 蛋白质组与转录组关联分析
5.2.6 ARG对三代虫ATP酶以及呼吸链复合物基因表达的影响
5.2.7 ARG对小林三代虫ATP含量的影响
5.3 讨论
5.3.1 iTRAQ技术为研究ARG的杀虫机制奠定基础
5.3.2 ARG作用下小林三代虫差异蛋白分析
5.4 小结
第六章 利用金纳米探针鉴定牛蒡子苷元作用小林三代虫靶点
6.1 材料与方法
6.1.1 供试动物
6.1.2 试剂与仪器
6.1.3 化合物2 的合成与杀虫活性评价
6.1.4 化合物6和10 的设计与合成
6.1.5 金纳米探针GNP-6和GNP-10 的合成
6.1.6 金纳米探针透射电镜观察
6.1.7 傅立叶变换红外光谱检测
6.1.8 HPLC-MS/MS定量配体
6.1.9 金纳米探针虫体摄取的电镜观察
6.1.10 金纳米探针离体杀虫活性评价
6.1.11 小林三代虫裂解液的准备
6.1.12 靶点蛋白的鉴定
6.2 结果与分析
6.2.1 化合物1-10 的结构表征
6.2.2 化合物2 在体作用小林三代虫活性
6.2.3 金纳米探针形貌观察和粒径分布
6.2.4 金纳米探针傅里叶变换红外光谱检测
6.2.5 金纳米探针的表面配体定量
6.2.6 金纳米探针虫体定位研究及杀虫活性评价
6.2.7 化合物1 的靶点鉴定
6.3 讨论
6.3.1 MyosinⅡ是ARG作用小林三代虫直接靶点
6.3.2 肌球蛋白是一类重要的药物驱虫靶点
6.4 小结
第七章 结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
本文编号：3835071
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