山葡萄CBL-CIPKs调控网络中两个关键基因响应逆境胁迫的功能分析
发布时间：2020-03-30 04:12
【摘要】：葡萄(Vitis L.)是世界上重要的经济类果树作物之一,目前生产上广泛栽培种以欧洲葡萄品种为主,其品质优良,但抗逆性普遍较差。冷(冻)害是限制葡萄生长发育的重要环境因子之一,严重影响葡萄的产量与品质,已成为我国北方寒地葡萄栽培中亟待解决的重要问题。山葡萄是葡萄属植物中抗寒性最强的种,并已成为世界葡萄抗寒育种的重要种质资源。Ca2+介导的CBL-CIPK调控网络在植物参与胁迫响应中发挥重要的作用,该调控网络中的一些成员的功能相继在模式植物拟南芥、水稻中被报道,然而有关葡萄属植物CBL、CIPK家族成员参与逆境胁迫响应的功能研究较少。本研究通过挖掘抗寒种质山葡萄CBL-CIPK家族中的关键成员,研究了 VaCBL01和VaCIPK02基因参与逆境胁迫的表达模式、定位、互作蛋白,以及参与逆境胁迫的功能特点。主要结果如下:1、山葡萄VaCBL01基因表达特性及与VaCIPKs蛋白互作分析。VaCBLL01在山葡萄根、嫩梢、卷须、花絮及幼叶中为组成型表达,卷须中具有较高的表达量。VaCBL01受ABA诱导表达,在12 h表达量较高,随后呈下调表达;VaCBL01受4℃低温胁迫诱导呈下调表达。VaCBL01与19个山葡萄VaCIPKs蛋白之间的相互作用的特异性和强度不同:VaCBL01与山葡萄12个CIPKs有强烈的互作;与5个CIPKs互作强度较弱,与2个CIPKs不互作,表明VaCBL01在解码Ca2+信号及形成CBL01-CIPKs复合体后转导信号的过程中起到重要作用。2、山葡萄VaCIPK02基因表达特性、亚细胞定位、转录活性、互作蛋白筛选与鉴定。VaCIPKK02在山葡萄不同组织中为组成型表达,但表达量有差别,其中根的表达较低,卷须中表达相对较高;VaCIPK02受4℃低温诱导呈上调表达,在6h时表达量达到较高。受ABA诱导呈下调表达。VaCIPK02蛋白定位于细胞核、叶绿体及细胞膜。VaCIPK02及VaCIPK02△NAF无自激活活性,但VaCIPK02△S_TKc具有自激活活性。VaCIPK02与山葡萄的4个CBLs互作(VaCBL01、VaCBL04、VaCBL05与VaCBL08);VaCIPK02自身不能形成同源二聚体。筛选山葡萄经-2℃低温诱导的酵母cDNA文库,筛选出20个互作蛋白,通过随机回复杂交验证表明VaCIPK02蛋白与VaPYL9互作。3、山葡萄VaCIPK02基因及其启动子在转基因拟南芥中的功能分析。同源克隆了VaCIPK02基因上游2269bp的启动子序列,构建了 ProaVaCIPK02::GUS融合表达载体,转化拟南芥获得转基因纯合体。GUS组织化学染色结果表明,VaCIPK02启动子受逆境胁迫(NaCl、甘露醇、4℃低温)与激素(ABA)诱导表达强度有差异。通过构建35S::VaCIPK02::EGFP植物表达载体,进行农杆菌转化获得VaCIPK02过表达转基因拟南芥材料,在ABA胁迫条件下,与WT相比,VaCIPK02过表达植株对ABA表现出超敏感性。
【图文】：
芥中ＡｔＣＢＬＯｌ以及毛果杨中ＰｔＣＢＬＯ丨蛋白相似度较大，分别达到９５．３％、９５．３％和９４．８％，与逡逑ＴａＣＢＬ０３蛋白相似性最低，为７７．３％。利用ＭＥＧＡ邋７．０软件中的最大似然法（Ｍａｘｉｍｕｍ邋ｌｉｋｅｈｏｏｄ），逡逑将山葡萄的ＶａＣＢＬＯ】序列与９个其他物种的ＣＢＬ蛋白构建系统进化树（图２－２）。经聚类分析逡逑后，，发现可聚类为２个分支，第一分支包括玉米ＺｍＣＢＬ０９、小麦ＴａＣＢＬＯｌ、水稻ＯｓＣＢＬＯｌ、逡逑番茄Ｓ１ＣＢＬ０４、大豆ＧｍＣＢＬＯｌ与木薯ＭｅＣＢＬ；第二分支包括毛果杨ＰｔＣＢＬＯｌ、拟南芥ＡｔＣＢＬＯ】、逡逑番茄Ｓ１ＣＢＬ０１与欧洲葡萄ＶｖＣＢＬＯｌ。其中，ＶａＣＢＬＯｌ与欧洲葡萄ＶｖＣＢＬＯ丨亲缘关系最近。逡逑９￣｜逦Ｚｅａ邋ｍａｙｓ邋ＺｍＣＢＬ０９邋ＮＰ邋００１１５邋Ｊ邋３１９．］逡逑逦Ｅ邋逦玉米邋Ｍ邋ＺｍＣＢＬＯ邋ｉ邋ＯＮＬ９９９０７．１逡逑■■逦逦小麦邋７＞ｖ／／ｃｒ＂ｍ邋ｔｆｉｓ／ｍｗｎ邋ＴａＣＢＬＵｌ邋ＡＦＲ９０２０８．１逡逑逦逦水稻（９＾２０邋似／ｉｗ邋ＯｓＣＢＵ）邋１邋ＸＰ邋０邋丨丨邋４２６Ｘ邋Ｊ逦ｆ逡逑４２逦．…．＂＂＂番菊逦ＳＩＣＢＬＭ邋ＸＰ邋｛）（Ｗ２４（Ｗ５７．１逡逑逦小麦邋Ｚｈ／ｉｎ／ｍ逦ＴａＣＢＬ０３逦ＡＦＲ９０２１０．１逡逑＾逦大豆逦ｗａｖ邋ＧｍＣＢＬＵｌ邋ＸＰ邋００３５３８７５９」逡逑１逦＿邋￣逦＼ｆａｎｉｈｏｉｔ＾ｃｕｉｔｍｔａ邋ＭｃＣＢＬ逦■■逡逑逦毛果杨尸0／讲／奶逦ＰｔＣＢＬＯｌ邋ＸＰ邋ＯＵ６３８５３７４．１逦逦逡逑逦逦邋逦拟南芥逡逑，，邋厂逦邋番获：办
均不能正常生长。在ＳＤＯ／Ａ／Ｘ培养基上阳性对照（ＡＤ－Ｔ邋＋邋ｐ５３／ＢＤ）正常生长并且变蓝，而双阴逡逑性对照（ＡＤ－Ｔ邋＋邋Ｌａｍ／ＢＤ和ＢＤ空载体）及１９个ＶａＣＩＰＫｓ／ｐＧＢＫＴ７单克隆菌株均不能正常生长逡逑（图２－５），证明１９个ＶａＣＩＰＫｓ均无自激活活性，为探宄山葡萄ＶａＣＢＬＯｌ与１９个ＶａＣＩＰＫｓ蛋白逡逑的互作提供理论依据。逡逑逦ｐＧＢＫＴ７－ＶａＣＩＰＫｓ逦邋ＮＥ逡逑．旁，公、在邋名；＿逡逑＾邋＾逦＾邋＾邋＾邋＾逦＾邋ｓｋ邋＾逡逑ＳＤ／－Ｔｒｐ逡逑■邋ＳＤ／－ＴｒｐＭｂＡ，Ｘ－ａ－ｇａｌ逡逑逦ｐＧＢＫＴ７－ＶａＣＩＰＫｓ逦Ｅｍｐｔｙ邋ＰＯ逡逑．／邋／邋／邋／邋／邋／逡逑Ｊ邋ＳＤ／－Ｔｒｐ／ＡｂＡ／Ｘ－ａ－ｇａＩ逡逑图２－５山葡萄ＶａＣＩＰＫｓ自激活活性分析逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｂａｉｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｏｆ邋ＶａＣＩＰＫｓ逡逑－１６－逡逑
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S663.1
本文编号：2607019
【图文】：
芥中ＡｔＣＢＬＯｌ以及毛果杨中ＰｔＣＢＬＯ丨蛋白相似度较大，分别达到９５．３％、９５．３％和９４．８％，与逡逑ＴａＣＢＬ０３蛋白相似性最低，为７７．３％。利用ＭＥＧＡ邋７．０软件中的最大似然法（Ｍａｘｉｍｕｍ邋ｌｉｋｅｈｏｏｄ），逡逑将山葡萄的ＶａＣＢＬＯ】序列与９个其他物种的ＣＢＬ蛋白构建系统进化树（图２－２）。经聚类分析逡逑后，，发现可聚类为２个分支，第一分支包括玉米ＺｍＣＢＬ０９、小麦ＴａＣＢＬＯｌ、水稻ＯｓＣＢＬＯｌ、逡逑番茄Ｓ１ＣＢＬ０４、大豆ＧｍＣＢＬＯｌ与木薯ＭｅＣＢＬ；第二分支包括毛果杨ＰｔＣＢＬＯｌ、拟南芥ＡｔＣＢＬＯ】、逡逑番茄Ｓ１ＣＢＬ０１与欧洲葡萄ＶｖＣＢＬＯｌ。其中，ＶａＣＢＬＯｌ与欧洲葡萄ＶｖＣＢＬＯ丨亲缘关系最近。逡逑９￣｜逦Ｚｅａ邋ｍａｙｓ邋ＺｍＣＢＬ０９邋ＮＰ邋００１１５邋Ｊ邋３１９．］逡逑逦Ｅ邋逦玉米邋Ｍ邋ＺｍＣＢＬＯ邋ｉ邋ＯＮＬ９９９０７．１逡逑■■逦逦小麦邋７＞ｖ／／ｃｒ＂ｍ邋ｔｆｉｓ／ｍｗｎ邋ＴａＣＢＬＵｌ邋ＡＦＲ９０２０８．１逡逑逦逦水稻（９＾２０邋似／ｉｗ邋ＯｓＣＢＵ）邋１邋ＸＰ邋０邋丨丨邋４２６Ｘ邋Ｊ逦ｆ逡逑４２逦．…．＂＂＂番菊逦ＳＩＣＢＬＭ邋ＸＰ邋｛）（Ｗ２４（Ｗ５７．１逡逑逦小麦邋Ｚｈ／ｉｎ／ｍ逦ＴａＣＢＬ０３逦ＡＦＲ９０２１０．１逡逑＾逦大豆逦ｗａｖ邋ＧｍＣＢＬＵｌ邋ＸＰ邋００３５３８７５９」逡逑１逦＿邋￣逦＼ｆａｎｉｈｏｉｔ＾ｃｕｉｔｍｔａ邋ＭｃＣＢＬ逦■■逡逑逦毛果杨尸0／讲／奶逦ＰｔＣＢＬＯｌ邋ＸＰ邋ＯＵ６３８５３７４．１逦逦逡逑逦逦邋逦拟南芥逡逑，，邋厂逦邋番获：办
均不能正常生长。在ＳＤＯ／Ａ／Ｘ培养基上阳性对照（ＡＤ－Ｔ邋＋邋ｐ５３／ＢＤ）正常生长并且变蓝，而双阴逡逑性对照（ＡＤ－Ｔ邋＋邋Ｌａｍ／ＢＤ和ＢＤ空载体）及１９个ＶａＣＩＰＫｓ／ｐＧＢＫＴ７单克隆菌株均不能正常生长逡逑（图２－５），证明１９个ＶａＣＩＰＫｓ均无自激活活性，为探宄山葡萄ＶａＣＢＬＯｌ与１９个ＶａＣＩＰＫｓ蛋白逡逑的互作提供理论依据。逡逑逦ｐＧＢＫＴ７－ＶａＣＩＰＫｓ逦邋ＮＥ逡逑．旁，公、在邋名；＿逡逑＾邋＾逦＾邋＾邋＾邋＾逦＾邋ｓｋ邋＾逡逑ＳＤ／－Ｔｒｐ逡逑■邋ＳＤ／－ＴｒｐＭｂＡ，Ｘ－ａ－ｇａｌ逡逑逦ｐＧＢＫＴ７－ＶａＣＩＰＫｓ逦Ｅｍｐｔｙ邋ＰＯ逡逑．／邋／邋／邋／邋／邋／逡逑Ｊ邋ＳＤ／－Ｔｒｐ／ＡｂＡ／Ｘ－ａ－ｇａＩ逡逑图２－５山葡萄ＶａＣＩＰＫｓ自激活活性分析逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｂａｉｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｏｆ邋ＶａＣＩＰＫｓ逡逑－１６－逡逑
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S663.1
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1 申威;山葡萄CBL-CIPKs调控网络中两个关键基因响应逆境胁迫的功能分析[D];宁夏大学;2019年
本文编号：2607019
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