一氧化氮与冷信号对桃果实2-Cys Prx蛋白和线粒体氧化还原信号的调控机理

发布时间：2020-04-09 18:06

【摘要】：线粒体是氧化还原代谢过程重要的细胞器,是细胞内合成ATP与氧化磷酸化的主要场所。过氧化物酶(Prxs)是一种基于硫醇的家族过氧化物酶,在活性氧(ROS)和NO信号通路相互作用中扮演着重要角色。一氧化氮(NO)是复杂信号转导过程中重要的分子,NO与活性氧(ROS)是应激条件下诱导信号转导的重要组成部分。目前对于NO与线粒体的研究主要集中于NO与线粒体呼吸、线粒体抗氧化系统等方面,而对线粒体氧化还原信号的影响鲜有报道。开展外源NO与冷信号对线粒体氧化还原信号相互作用的研究,有助于明确氧化还原代谢在果实采后贮藏的作用,以及NO与冷信号对线粒体氧化还原代谢的调控机理,对于维持果实采后品质,延长果实采后贮藏时间具有重要的意义。为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,本研究以肥城桃果实为实验材料,结合了PCR技术和RT-PCR等技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因。对该序列分析,2-Cys Prx基因全长1424 bp,其中编码区813 bp,共编码270个氨基酸,蛋白分子量为29.7 kDa。通过在线软件对其分子结构进行分析,2-Cys Prx蛋白分子式为C_(1342)H_(2110)N_(348)O_(403)S_4,理论等电点为6.23,为亲水性膜外蛋白。系统进化树分析表明,肥城桃果实2-Cys Prx蛋白与樱桃的亲缘关系最近。体外构建表达载体pET-30a-2-Cys Prx成功在大肠杆菌BL21中表达。外源NO对2-Cys Prx基因表达量的研究发现,NO延缓了冷藏和常温贮藏期间2-Cys Prx基因转录量的下降,而c-PTIO处理促进了该基因转录量的下降。外源NO对线粒体内源NO及氧化还原信号关键物质的研究结果表明,外源NO提高了贮藏期间S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)的活性,GSNOR活性的上调导致了S-亚硝基硫醇(RSNOs)的积累,因此桃果实线粒体内源NO处于较低的水平。在对线粒体氧化还原信号关键物质的研究发现,随着贮藏时间的延长,外源NO降低了线粒体NAD(P)H的含量,增加了NAD(P)~+/NAD(P)H ratio,使桃果实线粒体氧化还原电势处于较高水平,维持了氧化还原的平衡状态。此外,外源NO能够促进桃果实线粒体ATP的产生,下调ADP/ATP ratio,保持线粒体能量在较高水平。对线粒体关键酶活Mn-SOD活性的测定发现,NO降低了桃果实Mn-SOD活性,保护线粒体免受氧化应激损伤。植物有自我调节抗冷机制、接受低温刺激信号以抵御低温的能力。本研究对不同温度贮藏下线粒体氧化还原关键物质的分析发现,冷藏条件线粒体内源NO含量高于常温条件。外源NO处理后,低温冷藏降低了桃果实线粒体NAD~+/NADH ratio,提高了线粒体的能量水平,维持线粒体氧化还原的平衡,说明外源NO处理能够有效减缓桃果实冷胁迫的影响。此外,冷藏条件下GSNOR活性维持在较高水平。结果表明外源NO与冷信号通过调控线粒体内源NO含量、线粒体氧化还原信号关键物质及能量水平来维持线粒体氧化还原平衡状态,进而延缓细胞凋亡,延长桃果实贮藏期。
【图文】：

桃果实,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖,蛋白表达

桃果实总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图

温度梯度,琼脂糖凝胶电泳,产物

图 3 2-Cys Prx 温度梯度 PCR 产物的 1% 琼脂糖凝胶电泳图1: Marker 2000; 2: 58.0 °C; 3: 57.5 °C; 4: 56.6 °C;5: 55.2 °C; 6: 53.5 °C; 7: 52.3 °C; 8: 51.4 °C; 9: 51.0 °C。 (w/v) agarose gel eletrophoresis of 2-Cys Prx gene temperature gradient PCR prod1: Marker 2000; 2: 58.0 °C; 3: 57.5 °C; 4: 56.6 °C;5: 55.2 °C; 6: 53.5 °C; 7: 52.3 °C; 8: 51.4 °C; 9: 51.0 °C。x 基因全长的获取
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S662.1

【参考文献】