日本结缕草根际真菌及根系在盐胁迫下的转录组学研究

发布时间：2020-04-15 01:45

【摘要】：日本结缕草(Zoysia japonica)是非常重要的草坪草,耐逆性强、管理粗放及观赏性高等特点使得它被广泛应用于各种草坪的建植中。目前,己经有了大量关于结缕草的研究报道,包括优良品种选育、耐盐与耐低温的研究、病害防治的研究、分子标记的开发等等。结缕草的优良品质与根际环境中的微生物作用有很大的关系,然而,目前对结缕草耐盐性及根系微生物的研究还相对较少。因此,本项研究利用二代高通量测序的手段在两方面对结缕草的耐盐性进行研究。第一部分内容的研究是通过高通量测序获得大量根际真菌的基因信息,为以后筛选菌株研究真菌增强结缕草耐盐性提供研究基础;第二部分内容是获得大量结缕草耐盐候选基因,为结缕草本身耐盐的研究提供工作基础。研究的主要结果如下:1.通过Illumina的HiSeqTM2000测序平台,测得自然状态下生长的结缕草根系及根际微生物转录组。共获得5.49 Gb的数据量,拼接和组装后共得到了 68,024个unigenes,平均长度为 802.07 bp,N50 的长度为 1,193 bp。通过与 NR、Swiss-Prot数据库比对,分别获得了 49,334和30,159个注释的unigenes。在总unigenes中,分离出了 28,284条结缕草unigenes序列,同源性分析发现,结缕草的亲缘物种依次是谷子、高粱、玉米和水稻。基因功能注释的结果发现,18,719条unigenes富集在53个GO亚分类中,10,300条unigenes富集在了 24个COG分类中。KEGG注释中,有7,555条unigenes富集在124条代谢通路上。在总unigenes中,分离出了 18,889条真菌序列。在这些真菌里,有29种真菌的unigenes数超过了 100条,其中unigenes数最多的是Rhizophagusirregularis,两个亚种共包含4,074个unigenes。2.结缕草盐胁迫处理后的DAB染色法分析发现,10分钟内,根系表面就被诱导出了过氧化氢,到了 30分钟后,根系内部也充满了过氧化氢,说明ROS相关代谢途径已经被启动。对结缕草基因ZjNHX1进行半定量表达分析,发现该基因的表达量在20分钟的时间内出现了显著性上调,直到处理后2小时,该基因的表达量都显著高于处理前,说明SOS的代谢途径也正参与调控。20分钟时,ROS和SOS相关代谢途径被启动,因此,选取该时间点进行取样。3.对对照组(CK)和盐胁迫处理组(Case)分别进行转录组测序,混合拼接后共获得32,849条unigenes,平均长度为1,107 bp,N50为1,781 bp。基于RPKM的值分析,在两个文库中找到了 1,648个差异表达的unigenes,有948个unigenes表达上调,700个unigenes表达量下调。GO分类发现,1,455个差异基因富集在了 73个亚类中,并且67个亚类属于生化进程。近缘物种的耐盐基因比对分析表明,结缕草的耐盐调控方式与水稻和谷子更为接近。4.基于测序拼接获得的unigenes中,共预测到了 2,690个转录因子,隶属于80个转录因子家族。其中,成员数最多是AP2/EREBP家族,有187个,其次是bHLH家族和WRKY家族,分别为158个和137个。5.本实验在结缕草转录组研究的基础上,克隆出了一个NAC类基因。序列分析发现该基因序列包含1个完整的开放阅读框,长度为1,332 bp,编码了 449个氨基酸,包含一个NAM结构域。实时荧光定量PCR结果表明该基因会受到干旱、高盐及低温胁迫诱导,可能是胁迫反应中的重要基因。
【图文】：

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结缕草在自然状态下生长，根际周围会存在很多的微生物，包括细菌、真菌、节逡逑肢动物等等。结缕草的健康的生长离不开这些微生物的作用。因此，为研宄结缕草和逡逑微生物作用，我们必须将它们的序列与其他生物的序列分开。首先，分离结缕草的基逡逑因序列。下载邋ＮＣＢＩ邋（Ｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｃｅｎｔｅｒ邋ｆｏｒ邋Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）中植物基因的数逡逑据库，将所有ｉｍｉｇｅｎｅｓ和该数据库比对，被注释的ｕｎｉｇｅｎｅｓ可以认为是结缕草的，逡逑这部分序列数据称为Ｚ１。再将剩下的ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列与己有的结缕草数据库（Ａｈｎ邋ｅｔ邋ａｌ，逡逑２０１５）进行比对，得到了新的一部分ｉｍｉｇｅｎｅｓ序列，称为Ｚ２。将这两次比对的到的逡逑ｕｎｉｇｅｎｅｓ，Ｚ１和Ｚ２合并，就获得了本次结缕草测序的所有ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列。接着，开逡逑始分罔真菌的序列。将剩余的ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列（除去Ｚ１和Ｚ２的所有ｕｎｉｇｅｎｅｓ）与ＮＣＢＩ逡逑的真菌数据库进行比对分析，得到了真菌的ｉｍｉｇｅｎｅｓ序列。共得到了邋２８，２８４条结缕逡逑草的序列和１８，８９９条真菌序列。逡逑２．邋２．邋４．邋２．结缕草序列的ＮＲ注释逡逑ＮＲ注释的具体信息如下表所示。对结缕草的基因，我们做了进化分析，结果如逡逑下图，最相似的的物种是谷子有１１，４９６条序列与该物种亲缘性高，逡逑其次是高粱削６／ｃｏ／ｏｒ）和玉米（Ｚｅａ佭；Ａ？）分别有４，４４５和４，，４２１条亲缘序列。逡逑

日本结缕草根际真菌及根系在盐胁迫下的转录组学研究

图２－２：真菌种类分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋Ｓｐｅｃｉｅｓ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇｉ逡逑表２－５：邋ｕｎｉｇｅｎｅｓ数超过１００的真菌逡逑
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S688.4

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