CmRGlase3和CmLWRKY48基因调控甜瓜果实成熟的初步研究

发布时间：2020-04-23 23:40

【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是一种有重要经济价值和食用价值的作物,对甜瓜果实发育成熟分子机理的研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)为材料,根据甜瓜果实转录组数据,选择在果实不同发育时期有显著差异表达的基因CmRGlase3和CmLWRKY48为候选基因,进行了生物信息学分析、克隆、表达谱和遗传转化研究,取得的主要结果如下:(1)甜瓜全基因组中鉴定得到RGlase基因家族共有7个成员,且该基因家族成员在进化上相对保守;RGlase基因家族和WRKY基因家族分别同黄瓜、番茄中的同种家族的成员,进行系统进化树的构建,结果表明甜瓜和黄瓜属于直系同源。对启动子进行分析后发现,CmRGlase3包含o2-site(与蛋白质代谢相关的元件)、MSA-like(参与细胞周期调控的元件)和ABRE(参与脱落酸反应作用的顺势作用的元件);CmLWRKY48包含LTR(低温响应作用元件)、ABR E(参与脱落酸反应作用的顺式作用元件)和TCA-element(参与水杨酸反应作用的顺式作用元件)。(2)应用RT-PCR技术扩增得到CmRGlase3基因和CmLWRKY48基因的cDNA序列,长度分别为1572 bp和1524 bp。通过实时荧光定量PCR分析结果表明,CmRGlase3基因在果实中的表达量明显高于根、茎、叶中的表达量;而且在果实处于呼吸跃变期时表达量达到最大;CmLWRKY48基因在根、茎和叶中也有表达,其中在叶中的表达量较高;在果实中该基因的表达量同样在呼吸跃变期时达到最大值。结果与转录组数据相符。(3)分别构建了CmRGlase3和CmLWRKY48基因的超表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体,命名为pPRGlase3、pPWRKY48、pYL-RGlase3和pYL-WRKY48,采用子房注射法对甜瓜进行遗传转化。T_1代种子快速检测的平均阳性率分别为10.23%、9.52%、8.75%和8.61%。在对T_1代果实表型的观察中发现,实现CmRGlase3和CmLWRKY48基因超表达的T_1代果实都比对照组的果实更早成熟,分别平均比对照组提前6.2天和6.0天。初步研究结果表明,CmRGlase3和CmLWRKY48基因具有促进甜瓜果实成熟的作用。
【图文】：

质粒图谱,植物表达载体,离心管,冰水

内蒙古大学学硕士学位论文行转化，取连接产物 10.0 μL 于 1.5 mL 离心管中，放于冰水rans1-T1感受态细胞，立即放入冰水浴中，融化 2 min；融有连接产物的离心管中，液体打到离心管底部，吸打混匀后浴后，放入 42℃温水中进行热激，持续 30 s，注意放入温水水浴中，计时 2 min；冰水浴结束后，超净工作台中给每个的 LB 液体培养基；然后放入 37℃的摇床中，180 rpm 培养离心 2 min，吸弃上清液 600 μL，取 300 μL 菌液涂布于 LB 固，37℃过夜培养。载体的筛选R 方法进行初步筛选，阳性菌体的重组质粒再进行双酶切验证后将酶切验证正确的菌株进行保菌，放于㧟80℃以备用。构e3 和 pPWRKY48。

质粒图谱,中间载体,反应条件,模板

图 2.2 sgRNA 中间载体质粒图谱[77]Fig.2.2 Physical Map of the sgRNA Intermediate PlasmidsCR——制备 sgRNA 表达盒，反应体系和反应条件为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 5.0 μL，Pr0.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，，稀释后的连接产物 3.0 μL，引2.0 μL，ddH2O 补足至 20.0 μL。反应条件：94℃ 预变性 5 m5 s，68℃延伸 30 s，30 个循环；68℃延伸补平 7 min。反应结。，以第一次 PCR 产物为模板，反应条件：5×PrimeSTAR GXL BL DNA Polymerase 1.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，引物对（2.0 μL，模板 1.0 μL，使用 ddH2O 补足至 50.0 μL。反应时不加性 5 min；98℃变性 10 s，58℃退火 15 s，68℃延伸 30 s，30
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S652

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