黑莓RuTT12-1基因克隆与功能研究
发布时间：2020-04-25 03:32
【摘要】：黑莓(Rubusspp.)是应用于园艺栽培生产的蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物之一,因果实成熟过程中经历绿色、红色的变化,最后花青素苷(Anthocyanin)大量积累出现深红色接近黑色而得名。黑莓果实中类黄酮物质含量丰富,包括酚酸、原花青素(Proanthocyanidin,PA,也称缩合单宁)和花青素苷等。其中原花青素在幼果中的含量可以超过40 mg/g鲜重(Fresh weight,FW),但随着果实的成熟迅速减少,并且花青素苷逐渐积累;而黑莓果实的花青苷主要是矢车菊素-3-O-葡糖糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside,Cy3G),含量超过 1.76mg/gFW;TT12 定位于液泡膜上,是多药和有毒化合物排出家族(Multidrug and Toxic Compound Extrusion,MATE)成员之一,能特异地转运矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。同时,编码该蛋白的基因的突变能导致原花青素积累功能丧失。因此以富含花青素和原花青素的黑莓为试验材料研究TT12基因的功能,可以为利用基因工程技术对黑莓现有种质进行遗传改良提供参考依据。本研究根据已登录的黑莓转录组数据,结合GenBank数据库中已登陆的草莓、苹果、碧桃等TT12同源基因设计引物,分离出RuTT12-1基因的全长,并对其进行生物信息学分析。构建原核表达载体在大肠杆菌中对RuTT12-1进行诱导表达。构建过表达载体对RuTT12-1进行功能分析。主要结果如下:(1)通过同源基因克隆的方法从黑莓果实中获得了一个TT12基因的全长cDNA,命名为RuTT12-1(Genbank登录号:KX130853)。该序列长1659bp,包含一个1464 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码487个氨基酸,推断其编码的蛋白的相对分子量(Molecular Weight,MW)为53.09 kDa,等电点(PI)为5.416,具有典型的MATE家族保守结构域;跨膜结构预测显示,该蛋白含有十二个跨膜结构域。(2)氨基酸序列比对结果显示,RuTT12-1与多个物种TT12基因编码的蛋白具有较高的同源性,说明TT12基因在进化过程中较为保守。系统进化树表明RuTT12-1与森林草莓FvTT12具有最高的同源性,达到87%。(3)密码子偏好性分析显示,RuTT12-1基因表达量不高,偏好使用以A/T结尾的密码子,且7种最优密码子也均以A/T结尾。在密码子的使用频率上,RuTT12-1基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotianatobacum)的差异小于和玉米(Zeamays)、小麦(Triticum aestivum)的差异,因此拟南芥和烟草更适合作为该基因的异源表达宿主。通过与35种植物TT12基因密码子偏好系数对比分析,大部分TT12基因偏爱使用以A/T结尾的密码子,这可能与其功能有关。(4)成功构建了 原核表达载体 pET-32a(+)-RuTT12-1 及 pEASY-Blunt E1-RuTT12-1,在大肠杆菌中采用不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度条件下诱导RuTT12-1基因的表达,但均未能获得理想的结果,可能是由于RuTT12-1跨膜蛋白的疏水性结构过多,导致其在大肠杆菌中无法表达或表达过弱。成功构建了过表达载体pCAMBIA1301+-RuTT12-1。通过农杆菌介导的浸花法转化pCAMBIA1301+-RuTT12-1重组质粒到哥伦比亚野生型拟南芥中,使用潮霉素筛选出2株转入目的基因的阳性植株。与野生型拟南芥相比,转目的基因拟南芥植株中花青素含量增加,原花青素含量降低,认为黑莓RuTT12-1基因参与了花青素与原花青素的转运。
【图文】：
图２技术路线图逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ逡逑
２．１．２n牛恚虻娜た寺″义弦院谳耘嗥分帧粒颍幔穑幔瑁铩旃悖模危廖澹靡铮龋停旌停龋停步校校茫义义侠┰觯玫匠ぴ迹保叮埃板澹猓鸬奶醮ㄍ迹矗Ｍü夯厥铡⒘幼⒗栋装呱秆 ⒕义弦海校茫已橹ぁ⒅柿Ｌ崛 ⒁约懊盖屑ǖ龋肯盗谢蚩寺〔街杌竦弥刈橹柿＃粞″义先鼍ǖ陌装呖寺∽樱渌椭辽虾Ｉ锕こ逃邢薰窘胁庑颉ｅ义希湾澹卞义希龋绣义贤迹村澹遥裕校茫依┰龊谳罚罚罚餐椿蛉ゅ义献ⅲ海停哄澹玻埃埃猓疱澹模危铃澹蹋幔洌洌澹颍诲澹保阂镥澹龋停卞搴湾澹龋停插宓腻澹校茫义謇┰鲥义希疲椋纾澹村澹疲酰欤戾澹欤澹睿纾簦桢澹裕裕保插澹瑁铮恚铮欤铮纾铮酰箦澹纾澹睿邋澹悖欤铮睿澹溴澹妫颍铮礤澹猓欤幔悖耄猓澹颍颍澹悖觯粒颍幔穑幔瑁镥澹猓澹遥裕校茫义澹穑颍铮洌酰悖翦义希危铮簦澹哄澹停哄澹玻埃埃猓疱澹模危铃澹蹋幔洌洌澹颍诲澹校茫义澹幔恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮铄澹鳎椋簦桢澹穑颍椋恚澹颍箦澹龋停戾澹幔睿溴澹龋停玻义希玻财悖罚罚罚玻虻纳镅畔⒎治鲥义希玻玻卞澹浚鳎罚裕罚玻虮嗦氲陌被嵝蛄蟹治鲥义暇庑蚧竦贸ざ任保叮担瑰澹猓疱澹ㄓ缮舷掠我铮龋停焙停龋停怖┰龅玫剑┑男蛄小ｅ义暇危茫拢慑澹拢欤幔螅簦畏治觯飧鲂蛄屑次谳校罚裕粒驳耐椿蛐蛄小＠茫模危粒停粒五义先砑治觯诵蛄胁唤霭肫鹗济苈胱樱粒裕呛椭罩姑苈胱樱裕牵粒保场停怠义隙耍眨裕乙舶谀冢牵罚罚罚不蛉ば蛄校罚裕罚玻罚淇旁亩量蝈义铣ざ任保矗叮村澹猓穑嗦牒校矗福犯霭被岵谢牡鞍住：塑账嵝蛄型葱砸约鞍被徨义贤葱运得
本文编号：2639754
【图文】：
图２技术路线图逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ逡逑
２．１．２n牛恚虻娜た寺″义弦院谳耘嗥分帧粒颍幔穑幔瑁铩旃悖模危廖澹靡铮龋停旌停龋停步校校茫义义侠┰觯玫匠ぴ迹保叮埃板澹猓鸬奶醮ㄍ迹矗Ｍü夯厥铡⒘幼⒗栋装呱秆 ⒕义弦海校茫已橹ぁ⒅柿Ｌ崛 ⒁约懊盖屑ǖ龋肯盗谢蚩寺〔街杌竦弥刈橹柿＃粞″义先鼍ǖ陌装呖寺∽樱渌椭辽虾Ｉ锕こ逃邢薰窘胁庑颉ｅ义希湾澹卞义希龋绣义贤迹村澹遥裕校茫依┰龊谳罚罚罚餐椿蛉ゅ义献ⅲ海停哄澹玻埃埃猓疱澹模危铃澹蹋幔洌洌澹颍诲澹保阂镥澹龋停卞搴湾澹龋停插宓腻澹校茫义謇┰鲥义希疲椋纾澹村澹疲酰欤戾澹欤澹睿纾簦桢澹裕裕保插澹瑁铮恚铮欤铮纾铮酰箦澹纾澹睿邋澹悖欤铮睿澹溴澹妫颍铮礤澹猓欤幔悖耄猓澹颍颍澹悖觯粒颍幔穑幔瑁镥澹猓澹遥裕校茫义澹穑颍铮洌酰悖翦义希危铮簦澹哄澹停哄澹玻埃埃猓疱澹模危铃澹蹋幔洌洌澹颍诲澹校茫义澹幔恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮铄澹鳎椋簦桢澹穑颍椋恚澹颍箦澹龋停戾澹幔睿溴澹龋停玻义希玻财悖罚罚罚玻虻纳镅畔⒎治鲥义希玻玻卞澹浚鳎罚裕罚玻虮嗦氲陌被嵝蛄蟹治鲥义暇庑蚧竦贸ざ任保叮担瑰澹猓疱澹ㄓ缮舷掠我铮龋停焙停龋停怖┰龅玫剑┑男蛄小ｅ义暇危茫拢慑澹拢欤幔螅簦畏治觯飧鲂蛄屑次谳校罚裕粒驳耐椿蛐蛄小＠茫模危粒停粒五义先砑治觯诵蛄胁唤霭肫鹗济苈胱樱粒裕呛椭罩姑苈胱樱裕牵粒保场停怠义隙耍眨裕乙舶谀冢牵罚罚罚不蛉ば蛄校罚裕罚玻罚淇旁亩量蝈义铣ざ任保矗叮村澹猓穑嗦牒校矗福犯霭被岵谢牡鞍住：塑账嵝蛄型葱砸约鞍被徨义贤葱运得
本文编号：2639754
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/2639754.html
