蓝莓LAR、ANS、ANR植物表达载体构建及其转基因研究

发布时间：2020-04-26 00:28

【摘要】：本研究以原花青素含量较高的兔眼蓝莓‘灿烂’(V.ashei‘Brightwell’)和原花青素含量较低的北高丛蓝莓‘赫伯特’(V.corymbosum‘Herbert’)为实验材料,克隆了其叶片中的原花青素合成酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)、花青素合成酶(Anthocyanin synthase,ANS)基因,分别命名为VaLAR1、VaLAR2、VaANS和VcLAR1、VcLAR2、VcANS。通过序列分析得知两种材料相应同源基因仅有少数几个碱基位点的差异,相似性达99%;通过构建系统进化树得知上述基因与茶树的遗传距离最近。以来自‘赫伯特’的VcLAR1、VcLAR2、VcANS、VcANR(王丽金克隆)为目的基因,分别构建了烟草脆裂病毒(TRV)载体,通过农杆菌转化‘赫伯特’组培苗,对VIGS介导的‘赫伯特’组培苗基因沉默体系进行初步探索。结果表明,VIGS介导‘赫伯特’组培苗沉默最佳体系为:农杆菌菌液浓度OD_(600)值2.0,侵染时间为4 min,黑暗培养3 d后转移到光下,4周后采集样品进行检测。本实验成功沉默了‘赫伯特’组培苗VcLAR1基因,使其表达量下降,同时检测到其叶片中原花青素含量下降。以来自‘灿烂’的VaLAR1、VaLAR2、VaANS、VaANR为目的基因,分别构建植物双元载体pCAMBIA 1302的重组质粒,通过农杆菌转化来自‘赫伯特’组培苗的外植体,探究了其遗传转化体系。通过筛选,确定了‘赫伯特’外植体潮霉素(Hyg)抗性特点;通过正交实验,确定了‘赫伯特’最佳农杆菌侵染体系为:农杆菌浓度的OD_(600)值为0.7、侵染时间为10 min、黑暗条件共培养6 d;目前获得了转VaLAR1、VaLAR2、VaANS、VaANR基因的‘赫伯特’抗性愈伤。
【图文】：

还原酶,无色花青素,途径

不同的蓝莓品种叶片中原花青素含量差异很大[33]。素研究进展素（Proanthocyandins，，PA）是一类存在于植物体内的多酚类单体聚合形成[34]。PA存在于所有的植物体内，具有许多不同身而言可以防止食草动物的捕食和环境中病原体的攻击，以37]。PA也广泛存在于植物来源的食物中，特别是在水果、豆饮料中，如果汁、葡萄酒、苹果酒、茶和可可。PA的味道是有影响[38-42]。近年来，研究人员发现PA及其单体对人类健康具和抗癌活性，这些功能源于其具有较高的抗氧化和清除自由保护心脏、预防血栓形成、抵御紫外线等方面具有显著效果[开发利用，主要应用于保健品、食品和药品等领域[46]。

蓝莓,系统进化树分析,原花青素,合成酶

LAR、ANS 系统进化树分析从蓝莓叶片中获得的目的基因氨基酸序列与 NCBI 网站公布的其他植物基酸序列进行序列比对和同源性分析，并根据比对结果，使用 MEGA6.0于氨基酸序列的系统进化树，LAR、ANS 系统进化树结果分别为图 2-4 2-4 为 LAR 系统进化分析结果，从图中可以看出，百脉根（Lotus cornicuGlycine max）、菜豆（Phaseolus coccineus）等几种豆科植物的 LAR1 和序列聚为一支；而蓝莓叶片中得到的 LAR 序列与其他木本植物的聚为一（Fagopyrum dibotrys）、可可（Theobroma cacao）、葡萄（Vitis vinifeMalus domestica）、西洋梨（Pyrus communis）、甜樱桃（Prunus aviumragaria x ananassa）、玫瑰（Rosa rugosa）、啤酒花（Humulus lupulus）rella rubra）、提子（Vitis shuttleworthii）、金花茶（Camellia nitidissimaamellia sinensis）等，其中多数植物含有 LAR1 和 LAR2，少数植物只含蓝莓叶片中得到的 LAR 与金茶花、茶树的遗传距离最近。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S663.9

【参考文献】