苹果锌指蛋白MdZFP2在苹果抗旱、耐寒中的功能研究

发布时间：2020-05-08 15:07

【摘要】：我国是世界上最大的苹果生产国和消费国,但干旱和低温制约着黄土高原产区苹果产业的健康发展。利用苹果自身的基因资源,提高苹果的抗旱、耐寒能力具有重要意义。本研究从苹果品种‘金冠’中克隆到一个锌指蛋白基因,将其命名为MdZFP2。通过序列分析、亚细胞定位和qRT-PCR等方法,对MdZFP2的序列特征、细胞定位和表达特性等进行了探究,通过酵母双杂交技术筛选出2个与MdZFP2互作的蛋白,并利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证了该互作。此外,通过获得MdZFP2的干扰(RNAi)及过表达苹果转基因植物,对MdZFP2在响应苹果干旱和低温胁迫时的功能进行了初步探究。研究结果如下:1.本研究克隆到一个MdZFP2基因,位于5号染色体,开放编码阅读框为912 bp,编码303个氨基酸,蛋白分子量大小为33.93 kD。序列分析表明MdZFP2具有保守的锌指蛋白DNA结合结构域DOF。亚细胞定位结果表明MdZFP2定位于细胞核,属于典型的转录因子。MdZFP2基因启动子上含有两个响应MeJA的顺式作用元件和一个响应ABA信号途径的ABRE。2.组织特异性表达结果表明,MdZFP2在苹果的根、茎、叶中均有不同程度的表达,根系中MdZFP2表达量远高于茎和叶。MdZFP2响应干旱和低温胁迫,PEG处理6小时MdZFP2基因的表达量为处理前的6倍,自然干旱处理‘金冠’中的MdZFP2基因表达量随着处理时间延长而上升;而低温抑制MdZFP2的表达,4oC处理第12小时MdZFP2表达量降至最低,仅为处理0小时的0.17倍。除此之外MdZFP2也响应茉莉酸JA、水杨酸SA激素处理,表达量随两种处理时间延长而下降。3.构建了MdZFP2-pGBKT7载体,发现MdZFP2蛋白具有自激活活性,经过对其蛋白截断后获得无自激活的片段MdZFP2-510aa-BD。用MdZFP2-510aa-BD片段作为诱饵筛选MdZFP2的互作蛋白,获得了两个候选蛋白MdMIEL1和MdSNF1β2,前者编码一个RING型E3连接酶,后者则是构成SnRK1磷酸化复合体的亚基之一。酵母双杂交和双分子荧光互补技术证实了该蛋白互作。另外,通过染色质免疫共沉淀实验对MdZFP2下游靶基因进行了预测。4.构建MdZFP2干扰和过表达载体并转入苹果组培苗GL-3,获得了MdZFP2的RNAi和过表达植物。对RNAi转基因苹果植物进行长期干旱处理,发现长期干旱后MdZFP2 RNAi植物株高、茎粗、光合作用参数、地上部与地下部的导水率和生物量等显著低于GL-3,表明MdZFP2 RNAi植物对长期干旱处理更为敏感。随后用叶片自然失水实验进行验证,发现RNAi植物的叶片失水率显著高于GL-3,而过表达植株表现出相反的趋势。由此得出结论,MdZFP2参与苹果对干旱胁迫的响应,正调控苹果的抗旱性。另外,通过离子渗透率实验探究低温下RNAi转基因苹果植物叶片的耐寒性,发现在-4oC及-6oC时,RNAi植物叶片的相对离子渗透率均显著低于GL-3,表明MdZFP2 RNAi植物的耐寒性更强。
【图文】：

图 1-1 拟南芥中的冷信号感知和反应通路（Guo et al. 2018）Figure 1-1 Cold signal perception and responsive pathway in Arabidopsis（Guo et al. 2018）.2.2 苹果耐寒性研究进展近年来，随着拟南芥、水稻等作物低温信号转导途径的深入研究，，关于苹果耐的分子机制的发掘得到显著发展。对低温胁迫的苹果进行的的非靶向差异凝胶电示有三种脱氢蛋白 MdDHN2、MdDHN4 和 MdDHN6 大量积累，其中 MdDHN2dDHN4 发生磷酸化，在苹果应对低温胁迫的适应性中发挥关键作用（Perttu et017）。苹果中的一个 E3 连接酶 MdSIZ1 在低温胁迫下可将 MdMYB1 进行 SUMO 化进花青素的积累，提高果实抗寒性（Zhou et al. 2017）；MdNAC029 识别并结dCBF1 和 MdCBF4 的启动子，负调控苹果耐寒性（An et al. 2018）；MdMYB88/1接调控冷诱导基因 MdCSP3 和 MdCCA1，MdCCA1 而非 MdCSP3 在冷胁迫下可以 MdCBF3 的表达。此外，MdMYB88/124 可以促进花青素积累和 H2O2解毒作用增果耐寒性（Xie et al. 2018）。bZIP 型转录因子 HY5 在冷胁迫下上调表达，MdHY5 直接结合 MdCBF1 启动子上的 G-Box 负调控其表达，除此之外，MdHY5 也可以

第三章 结果与分析第三章 结果与分析3.1 MdZFP2 的克隆与启动子分析3.1.1 MdZFP2 的克隆与序列分析本实验以‘金冠’为材料，克隆出 912 bp 的序列，编码 303 个氨基酸，蛋白分子量大小为 33.92 kD，根据 NCBI 的预测分析发现序列具有典型的 DOF 结构域，属于DOF 类锌指蛋白转录因子，将其命名为 MdZFP2。将蛋白序列与桃、葡萄、杨树、拟南芥、玉米等常见植物的锌指蛋白序列比对，如图 3-1 所示，MdZFP2 蛋白 N 端存在保守的 DNA 结合结构域 DOF。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.1

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本文编号：2654841