低温胁迫下番茄MYB113基因的功能分析

发布时间：2020-05-13 07:13

【摘要】：番茄是我国北方地区广泛种植的蔬菜作物。作为一种喜温蔬菜,番茄在冬春季节极易受低温伤害,从而影响产量与品质,造成巨大的经济损失。低温胁迫分为冷害(0-10℃)和冻害(0℃以下)。番茄遭受冷害时会积累大量活性氧,造成膜脂过氧化,并且冷害还会对番茄的光合机构和光合作用造成严重的影响,导致其生长发育迟缓、座果率下降、畸形果数量增加,严重时会导致植株死亡。花青素是一种天然的水溶性色素,因其具有抗氧化能力,所以在一定程度上能缓解低温对番茄的伤害。花青素的合成受到多个基因的调控和多种环境因素的影响,调控花青素合成的转录因子主要包括MYB、bHLH、WD40等家族。MYB转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一,在不同植物中参与多种生理生化过程的调节,并且MYB转录因子家族还参与植物对低温等逆境胁迫的响应。番茄基因组中共有127个MYB转录因子,目前关于它们功能的报道还较少。本实验从番茄中分离得到了一个MYB转录因子基因(SlMYB113),以过表达SlMYB113的转基因番茄与野生型植株为实验材料,研究了该基因对番茄低温抗性及低温胁迫下花青素合成过程的影响。该研究结果对于阐明MYB转录因子在番茄低温抗性中的功能具有重要意义。主要研究结果如下:(1)根据SGN网站(https://solgenomics.net/)上已知的SlMYB113的基因序列设计引物,以番茄的cDNA为模板,通过PCR反应获得SlMYB113基因的全长。SlMYB113基因全长950 bp,开放阅读框780 bp,编码259个氨基酸。氨基酸同源比对和进化树分析发现SlMYB113属于R2R3型的MYB转录因子。(2)构建SlMYB113-GFP载体和SlMYB113-FLAG载体,分别转化农杆菌菌株GV3101和LBA4404,将含有SlMYB113-GFP质粒的GV3101和含有SlMYB113-FLAG质粒的LBA4404分别瞬时转化烟草和在番茄中稳定表达,然后分别通过激光共聚焦显微镜观察和Western-blot分析SlMYB113蛋白的亚细胞定位,结果表明该蛋白定位于细胞核。(3)通过qRT-PCR分析了SlMYB113在不同胁迫下的表达模式,发现SlMYB113受低温、干旱等胁迫和赤霉素等信号分子的诱导表达。组织表达分析结果表明SlMYB113在叶片中的表达量最高。(4)构建pBI121-SlMYB113的过表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,获得过表达SlMYB113的转基因番茄植株,对转基因株系进行筛选鉴定并选取表达量高的OE-8、OE-11和OE-22株系进行后续的实验。(5)与野生型相比,在正常条件和低温处理下,过表达SlMYB113的转基因番茄叶片中花青素的积累显著增加,使叶片背面呈现明显的紫色。而且一些花青素合成相关的基因在转基因番茄中的表达被明显上调,这说明SlMYB113参与了番茄花青素合成过程的调控。(6)低温胁迫下,转基因SlMYB113番茄和野生型的MDA积累量和REC都上升,转基因番茄的增加量低于野生型,这说明在低温胁迫下转基因番茄的细胞膜受损程度低,低温耐受力高。在低温胁迫下,转基因番茄的活性氧积累量比野生型低,但是转基因番茄中的抗氧化酶活性比野生型弱,这说明转基因番茄中的活性氧可能被花青素清除。(7)通过酵母单杂交实验和转录激活实验证明了SlWHY1能与SlMYB113互作,SlWHY1能结合在SlMYB113基因的启动子上,并且能促进SlMYB113的表达。这说明SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。实验结论:我们从番茄中分离得到了一个R2R3类型的MYB转录因子SlMYB113。该基因全长980 bp,开放阅读框全长780 bp,编码259个氨基酸。该基因的产物定位于细胞核;SlMYB113的表达受低温、干旱和赤霉素等多种胁迫和激素诱导,且在叶片中表达量最高;过表达SlMYB113增加花青素的积累,从而提高了转基因番茄的低温抗性;SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。
【图文】：

花青素,化学结构,香豆酸,辅酶A

素主要通过清除氧自由基提高植物的低温、干旱等逆境胁迫的耐受能力，保护植物免受伤害（Hatieratier et al., 2013）。图1-1 花青素的化学结构（王辉等，2009）Fig.1-1 Chemical construction of anthocyanidin (Wang et al., 2009)1.2.2 花青素生物合成途径花青素的生物合成途径分为以下三个阶段（图1-2）：第一阶段：苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）使苯丙氨酸脱氨形成肉桂酸（ trans-cinnamic acid ），肉桂酸 4- 羟化酶（ cinnamic acid4-hydroxylase, C4H）使肉桂酸羟化生成p-香豆酸（p-coumaric acid），p-香豆酸通过4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumaric acid CoA ligase, 4CL）的催化生成p-香豆酰辅酶A；在乙酰辅酶A连接酶(acetyl-Co A ligase, ACL）和乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的共同作用下使乙酸生成丙二酰辅酶A（Spelt et al.2000）。

花青素,转录因子

山东农业大学硕士学位论文11图1-2 花青素合成途径（梁等，2018）Fig.1-2 Synthetic pathway of anthocyanidin（liang et al.,2018）1.2.3 花青素合成的分子调控机制花青素的合成过程受到多种转录因子的调控，例如：MYB、bHLH、WD40、bZIP和WRKY等（Nakatsuka et al., 2005）。参与调控花青素合成的转录因子主要集中在MYB、bHLH和WD40这三个转录因子家族中。MYB转录因子中参与花青素生物合成过程的主要是R2R3和R3这两种类型（Lin etal., 2010）。棉花中的两个R2R3类型的MYB转录因子GhMYB10和GhMYB36与拟南芥中的AtTT2高度同源，能激活花青素合成相关基因的表达促使棉花花青素过量积累（Lu etal., 2017）。水芹菜中的OjMYB1作为一个R2R3类型的MYB转录因子直接结合到 AtTT8和 AtEGL3的启动子上并上调花青素合成相关基因的表达，使水芹菜呈现出花青素过量积累的表型（Feng et al., 2018）。胡萝卜中的DcMYB6过表达会导致胡萝卜主根中的花青素过量积累，种子和叶片中花青素含量升高（Xu et al., 2017）。bHLH转录因子是植物中的转录因子家族之一，，其特征是含有一个与DNA结合的
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S641.2

【参考文献】