野生柑橘花青苷积累的调控机理研究

发布时间：2020-05-15 19:41

【摘要】：柑橘作为世界上最重要的果树之一,许多种类的柑橘都能积累花青苷。花青苷属于黄酮类化合物家族,是植物的次生代谢物质,对柑橘果实品质的形成、逆境的抵抗及人类健康等方面都有非常重要的作用。目前柑橘中花青苷的调控研究,在血橙(Citrus sinensis)中有深入的研究,对于其他积累花青苷的柑橘品种的花青苷调控研究较少。柚子是柑橘的三大基本种之一,目前所有的栽培柚子果实不积累花青苷,果皮主要呈现黄色或是橙黄色。本课题组在湖北恩施找到了一份野生的柚子资源“紫皮柚”(Citrus maxima),可以在果皮中积累花青苷而呈现不同于普通栽培柚子的紫红色。关于紫皮柚花青苷积累的机制还不清楚。蚝壳刺作为柑橘的一个原始种(Atalantia buxifolia),果皮和嫩叶中都可以积累花青苷,且果皮和嫩叶中积累的花青苷成分差别很大,这暗示着蚝壳刺果实和嫩叶中花青苷的调控机制是不一样的。因此,本研究以紫皮柚和普通柚子作为研究材料,系统的研究紫皮柚中花青苷的调控机制。此外,本论文在紫皮柚的研究基础上,以原始的柑橘品种蚝壳刺作为研究材料,更进一步的探索了柑橘中的花青苷调控机制。主要研究结果如下:1、紫皮柚花青苷成分鉴定及调控基因挖掘。首先利用高效液相色谱(HPLC)技术鉴定了紫皮柚果皮花青苷的主要成分是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊色素-3-O-(丙二酰葡萄糖苷)。通过分析紫皮柚和普通柚子成熟时期果皮基因表达谱数据,本研究鉴定到了1667个差异表达基因,其中包括915个上调的基因,712个下调的基因,并且花青苷生物合成途径相关的基因均有明显的上调。通过qRT-PCR技术,鉴定到CgCHS1,CgF3H,CgF3’H,CgDFR,CgANS,CgUFGT1和CgUFGT2以及负责花青苷转运的CgGST基因的表达情况与紫皮柚果实发育时期花青苷合成呈明显的正相关,调控基因CgRuby1和CgbHLH1也具有类似的表达模式,因此被筛选作为候选基因。本研究在CgRuby1基因上游6.7 kb的位置找到了一个候选的MYB转录因子,通过qRT-PCR及western-blot技术发现这个基因在转录水平和蛋白水平的表达模式与CgRuby1相反,且该基因蛋白的R2R3结构域均不完整,因此将这个基因命名为CgRuby2~(Short)作为候选基因进行研究。2、提出了紫皮柚花青苷合成调控模型。首先通过草莓瞬时表达和拟南芥稳定表达鉴定了CgRuby1是花青苷合成的激活子,而CgRuby2~(Short)是花青苷合成的抑制子。在双荧光素酶实验中,CgbHLH1的加入,促进了CgRuby1对花青苷结构基因启动子的激活,而CgRuby2~(Short)抑制了CgRuby1-CgbHLH1复合体的激活能力。通过启动子元件和活性分析发现,紫皮柚果皮CgRuby1的上调表达,是由于该基因启动子中的CAAT-box和TATA-box元件均是完整的,因此可以使该基因能够正常表达,而普通柚子中这两个元件突变后启动子没有活性因此CgRuby1不能表达。通过酵母单杂和凝胶电泳迁移实验发现,CgRuby1可以结合到花青苷结构基因(CgF3'H和CgDFR)的启动子,而CgRuby2~(Short)不能。通过酵母双杂,双分子荧光互补及GST pull-down实验,本研究验证了CgRuby1和CgRuby2~(Short)均能分别与CgbHLH1互作,同时通过竞争性的GST pull-down实验验证了CgRuby2~(Short)能与CgRuby1竞争CgbHLH1。因此推导出CgRuby1是紫皮柚积累花青苷的关键激活子,而CgRuby2~(Short)能与CgRuby1竞争CgbHLH1形成没有活性的复合体,作为一个被动的花青苷抑制子起作用的调控模型。3、紫皮柚花青苷合成受光照诱导。通过套袋实验,发现紫皮柚花青苷的积累受到光照的影响。qRT-PCR实验验证了花青苷的关键结构基因及调控基因(CgRuby1)的表达也受到光照的影响。启动子元件和活性分析表明,CgRuby1启动子是一个光诱导型启动子,明显的受到光照影响,而低温对CgRuby1启动子的活性则没有任何影响,这表明紫皮柚花青苷的调控机制与血橙花青苷受冷诱导的机制是不一样的。4、蚝壳刺花青苷调控基因的挖掘及功能鉴定。通过LC-MS/MS的广泛靶向代谢组学方法,鉴定到蚝壳刺成熟果实中花青苷的主要成分矢车菊色素、飞燕草色素以及这些成分的衍生物。通过qRT-PCR,本研究发现AbRuby1和AbRuby2基因分别在积累花青苷的果实和叶片中特异表达。通过比较AbRuby2和CgRuby2~(Short)的蛋白序列,发现AbRuby2的R2R3结构域是完整的,因此命名为AbRuby2~(Full)。进一步研究发现,AbRuby2~(Full)可以促进草莓和拟南芥中花青苷的合成,且可以结合到花青苷结构基因的启动子上促进启动子活性,是一个柑橘中新发现的调控花青苷的激活子。AbRuby2~(Full)的启动子有MITE插入,通过重亚硫酸盐测序的方法,本研究发现蚝壳刺积累花青苷的嫩叶AbRuby2~(Full)的启动子甲基程度比不积累花青苷的老叶甲基化程度显著降低,这影响了AbRuby2~(Full)在嫩叶和老叶的表达,因此造成了花青苷在不同时期的积累差异。
【图文】：

示意图,花青苷,代谢途径,示意图

野生柑橘花青苷积累的调控机理研究花青素稳定性不佳，紧接着经过 UFGT 的修饰作用，，经过糖形成稳定的花青苷产物。苷是在内质网中面向细胞质的一侧合成的，然后被输送到液道几种负责植物中花青苷转运的工作机制，其中包括谷胱甘肽有毒化合物排出家族（MATE）等。GST 是通过将谷胱甘肽化合物结合而参与细胞解毒的二聚体酶(Cheng et al 2015)。+/Na+浓度差产生的电化学势能，将花青苷从内质网输送到液物的组织显现各种不同颜色(Marinova and Klein 2007)。

果肉,柚子,果皮,花青苷

华中农业大学 2018 届博士研究生学位（毕业）论文是果皮还是果肉，在整个果实发育时期都不积累花青苷（图 2-1A 和图 2-1B）。用高效液相色谱（HPLC）进一步分析表明，紫皮柚果皮花青苷主要成分是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊色素-3-O-(丙二酰葡萄糖苷)，且二者的比例约为 1:6（图 2-1C）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S666

【参考文献】