百合多倍体诱导技术及多倍化效应研究

发布时间：2020-05-21 10:07

【摘要】：百合(Lilium spp.)在世界花卉产业中占有重要地位。多倍体育种是培育性状优良的新品种和恢复远缘杂交F1代育性的有效途径,其中无性多倍化和有性多倍化是多倍体育种的主要方式。我国拥有众多的百合资源,但在百合育种方面起步较晚,自主培育的商品性状优良、在国际范围内被广泛认可的品种尚少。本研究围绕百合离体染色体加倍、2n配子的诱导、三倍体中天然可育配子发生及其细胞学机制,以及多倍体检测等染色体加倍技术进行了研究,主要结果如下:(1)建立了以试管鳞茎为材料的离体染色体加倍技术流程。根据Lg(34)正交设计分析,比较了不同预培养时间、秋水仙素浓度和处理时间对四倍体诱导率的影响,优化了异源四倍体诱导的最佳处理组合为鳞片预培养6天、0.05%的秋水仙素处理24h。为分析秋水仙素诱导获得的四倍体植株的核型稳定性,结合45S-FISH和GISH进行了核型分析,结果表明四倍体在经过多代繁殖后具有稳定的核型结构。与二倍体相比,四倍体植株在表型性状上表现出多倍体植株的大部分特征。花粉育性检测后回交共获得258个基因型回交一代三倍体杂种,表明远缘杂种F1代在四倍体水平恢复了育性。(2)建立了以种子为材料的离体染色体加倍技术及快速倍性鉴定流程。在离体培养条件下,萌动培养7天的种子,经0.10%的秋水仙素溶液处理36h诱导效果最好,四倍体诱导率达44.43%。通过下胚轴膨大植株数与四倍体植株数之间的相关性分析得出,相关性达73.97%,表明有斑百合种子下胚轴的膨大可作为早期筛选多倍体的有效指标。二倍体植株与四倍体植株存在明显的表型差异。研究还发现,植株外部形态变化不仅存在于二倍体和四倍体之间,而且不同基因型的四倍体之间也存在差异。(3)建立了亚洲百合人工诱导2n花粉的技术流程。提出以单株最大花蕾发育形态为参照即时判别亚洲百合减数分裂进程的方法。在对同一单株不同大小花蕾减数分裂进程检测的基础上,发现单株最大花蕾小孢子母细胞减数分裂处于中期Ⅰ,其余大部分小孢子母细胞减数分裂处于前期Ⅰ-中期Ⅰ,为秋水仙素人工诱导2n花粉的最佳处理时期、最佳的处理浓度为0.2%,最高2n花粉诱导率为18.3%。利用2n花粉杂交共获得40个基因型三倍体开花植株。(4)以远缘杂种三倍体OT杂种系中具可育雌雄配子的品种为材料,验证其配子的育性及其雄配子形成的细胞学机制。花粉染色和萌发观察表明:该基因型能产生具有活力的单粒花粉和连体花粉,大部分萌发的连体花粉具有两根花粉管。小孢子母细胞减数分裂观察表明,减数分裂过程中异常的纺锤体定向、细胞质分裂异常和细胞融合现象等是产生功能性雄配子的主要细胞学机制。以三倍体为亲本进行正反交共获得275个基因型的再生植株。对28个杂交后代进行倍性检测,染色体数目为24-36,表明该三倍体能产生具有活力的单倍体配子(x)、未减数配子(2x)和非整倍体配子。
【图文】：

预培养,鳞片,情况,秋水仙素

．．．将无菌组培苗转接到培养基配方为ＭＳ＋８０ｇ／Ｌ蔗糖＋７ｇ／Ｌ琼脂＋ｌｇ／Ｌ邋ＡＣ邋（ｐＨ＝５．８）逡逑的淲茎膨大培养基中。选取培养４个月，直径为１．５－１．８ｃｍ的无菌组培小淲茎。剥取逡逑淲茎中层和外层淲片，横切鳞片基部宽0．８－ｌｃｍ的切片，接种到培养基配方为ＭＳ＋２逡逑ｍｇ／Ｌ邋６－ＢＡ＋０．１邋ｍｇ／ＬＮＡＡ＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋７ｇ／Ｌ琼脂（ｐＨ＝５．８）的不定芽诱导培养基，预培逡逑养６、１５和２５天后进行后续实验。培养条件为温度２２±２°Ｃ，，光照强度４５＠0１邋／ｍ２／ｓ，逡逑光照时间每天１６ｈ。逡逑２．１．３．离体多倍体诱导逡逑秋水仙素用２％的ＤＭＳ？溶解，配制成质量百分含量为１％的母液，存放在棕逡逑色瓶４°Ｃ保存，使用时稀释母液至质量百分含量为０．０５和０．１０％的溶液，以无菌蒸馏逡逑水为对照（相当于秋水仙素质量百分含量为0％），高压１１８°Ｃ灭菌１８ｍｉｍ备用。将不逡逑定芽诱导培养６、１５和２５天的鳞片切片（图２－１）从组培瓶中取出，无菌水冲洗三遍，逡逑去除淲片上附着培养基，无菌滤纸吸千水分，将淲片浸泡在预先灭菌过的秋水仙素溶逡逑液中。静置于组培室黑布覆盖，分别浸泡１８、２４和３６ｈ。通过对无菌试管小鳞茎鳞逡逑片切片不同预培养时间，不同秋水仙素浓度及不同处理时间参照正交表设计三因素三逡逑水平正交试验。每个处理１０个淲片切片，重复３次，共９个组合。数据以平均值土逡逑

四倍体,二倍体,四倍体诱导

逦百合多倍体诱导技术及多倍化效应研宄逦逡逑表２－６单变量方差多重比较分析逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－６邋Ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｉｎ邋ＡＮＯＶＡ逡逑处理（天）四倍体诱导率（％）邋处理邋（％）逦四倍体诱导率（％）处理逦（ｈ）四倍体诱导率（％）逡逑６逦３１．９５±９．０８ａ逦秋水逦０．００逦０．００±０．００ｂ逦１８逦８．６６±３．３８ｃ逡逑预培养逦处理逡逑１５逦９．２０±３．２３ｃ逦仙素逦０．０５逦３０．１５±６．００ａ逦２４逦３１．５５±８．４６ａ逡逑时间逦时间逡逑２５逦２０．８３士邋６．８０ｂ逦浓度邋０．１０逦３１．８２±７．４５ａ逦３６逦２１．７７士邋７．４６ｂ逡逑￣注：均值代表三个重复的平均值±标准误，同列数据小写字母表示Ｐ＜０．０５，相同字母之间表示差逡逑异不显著，不同字母之间表示差异显著。逡逑综上所述，百合远缘杂交ＦＯ杂种无菌鳞片切片异源四倍体诱导的最佳处理组合逡逑为：淲片切片预培养７天、０．０５％的秋水仙素处理２４ｈ。正交试验筛选的最佳组合正逡逑好为正交表中的处理组合２。逡逑逦—
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S682.29

【参考文献】