金柑类黄酮糖基转移酶基因的筛选与克隆

发布时间：2020-05-25 13:21

【摘要】：金柑(Kumquat)原产于我国,是芸香科(Rutaceae)金柑属(Fortunella)植物,为常绿灌木或小乔木。类黄酮是金柑果实中最重要的次生代谢产物之一,某些类黄酮成分具有清除人体内产生的自由基,预防心脑血管疾病、抗衰老及抗癌等营养保健功效。类黄酮在植物中主要以糖基化的形式存在,糖基化修饰提升了类黄酮的稳定性和水溶性,增加了其在植物体内的积累。糖基化修饰主要由UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)催化完成的。植物中UGT基因通常以基因家族的形式存在,且数量众多。如何从这些家族成员中准确筛选出参与类黄酮糖基化修饰的UGT,是功能研究中最为关键的一步。本研究以浏阳金柑(Fortunella crassifolia Swingle)果实为实验材料,首先利用靶向代谢组学技术对金柑果实各发育时期类黄酮进行了种类鉴定与相对定量分析,再通过转录组测序技术筛选了高表达的UGT基因,并结合相应生物信息学方法及代谢组实验确定了与金柑类黄酮合成相关的UGT候选基因,并完成了部分基因的克隆与测序工作。研究结果为进一步的功能鉴定等研究奠定了一定的基础。本实验取得的主要结果如下:1.利用液相色谱-高分辨质谱联用仪(UPLC G2-S QTOF)对浏阳金柑果实类黄酮种类进行了检测,鉴定出了11种类黄酮,包括2种C-葡糖苷类黄酮、5种C-新橙皮糖苷类黄酮及4种O-新橙皮糖苷类黄酮,分别为维采宁-2(Apigenin-6,8-di-C-glucoside)、3',5'-双碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素(3',5'-di-C-β-glucopyranosylphloretin)、木犀草素-8-C-新橙皮糖苷(Luteolin-8-CNeohesperidoside)、木犀草素-6-C-新橙皮糖苷(Luteolin-6-C-neohesperidoside)、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷(Apigenin-8-C-neohesperidoside)、刺槐黄素-8-C-新橙皮糖苷(Acacetin-8-C-neohesperidosid)、刺槐黄素-6-C-新橙皮糖苷(Acacetin-6-C-neohesperidoside)、野漆树苷(Apigenin7-O-neohesperidoside)、柚皮苷(Naringenin-7-O-neohesperidoside)、金柑苷(Acacetin7-O-neohesperidoside)、枸橘苷(Isosakuranetin7-O-neohesperidoside)。2.通过液相色谱峰面积,对浏阳金柑果实中含量较高的5种类黄酮(3',5'-双碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黄素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黄素-6-C-新橙皮糖苷、金柑苷)做了相对定量分析,探讨了其含量在浏阳金柑果实各发育阶段的变化规律。结果发现,芹菜素-8-C-新橙皮糖苷的含量在果皮中呈现先下降后上升再下降的趋势,在果肉中整体呈下降趋势;其他类黄酮的变化趋势基本一致,整体呈下降趋势,且前期下降较快;3',5'-双碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素在浏阳金柑果实整个发育过程中的含量最高;另外,结果显示浏阳金柑果皮中类黄酮的含量普遍高于果肉。3.通过高通量测序技术对6个不同发育时期10个浏阳金柑果实样品进行转录组测序,以克莱门氏小柑橘(Citrus clementine)的基因组为参考对转录组数据进行分析,最终获得高表达基因11350个。利用克莱门氏小柑橘蛋白数据库对上述基因进行注释及基序(Motif)检测,最终界定49个高表达的FcUGT基因。4.基于转录组FPKM值分析基因表达模式,结果发现不同基因表达模式差异显著。在果皮中,以花后99天为分界点,将这49个FcUGT基因分为两种表达模式。第一种模式包含了24个FcUGT基因,我们发现这些基因在“花后99天”,这个分界点之前有更高的表达量;第二种模式包含了25个FcUGT基因,这些基因在“花后99天”,这个分界点之后有更高的表达量。相较于果皮,49个基因中的大部分基因在果肉中呈现一个低表达模式。5.以49个FcUGT基因和39个功能已知UGT基因的编码蛋白序列构建进化树,并结合浏阳金柑果实中类黄酮糖元的种类及结构,对FcUGT基因功能进行预测。发现其中25个高表达的UGT可能参与了类黄酮糖基化修饰,并完成了8个糖基转移酶候选基因的克隆与测序工作。
【图文】：

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称取上述过 40 目筛子后的粉末样品 0.5g 于 10mL 离心管，加入 7mL 纯甲醇，混匀，超声破碎 30min（功率 60%，水温 45℃），5000rpm 离心 15min，取上清液于 25mL 棕色容量瓶，残渣继续加入 7mL 纯甲醇，重复提取 3 次，用甲醇定容至25mL，取适宜提取液，加入适量去离子水稀释，过 0.2μm 膜，放 4℃冰箱备用。3.2.2 超高效液相色谱（UPLC）条件对于 UPLC 条件的确定，在杨莹等（2016）研究的基础上，作了适当的调整，提高了金柑果实中类黄酮物质的分离效果，在 8min 之内基本上能将提取出来的类黄酮全部分离开。如图 3-1 所示，为浏阳金柑果实一个时期类黄酮的液相色谱图。具体色谱条件如下所示:UPLC 检测使用 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1×100 mm, 1.7μm，Waters，美国）；流动相 A 为 0.01%甲酸，B 为乙腈；流速为 0.3 mL.min-1；柱温：40℃；进样量为 1μL（每个样品重复检测 3 次）；检测波长为 283nm、330nm、365nm；检测范围为 200nm-400nm。浓度梯度如下：0 min: 90% A+ 10% B; 2 min: 80% A+20% B; 5 min:75% A + 25% B; 9 min:65% A + 35% B。

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西南大学硕士学位论文20图3-3 金柑果实中类黄酮的结构。Nh代表新橙皮糖苷Fig.3-3 Structures for flavonoids found in fruits. Nh represents Neohesperidose3.3.3 浏阳金柑果实各发育时期类黄酮的相对定量分析因浏阳金柑果实中含量较多的几种类黄酮国内无商业化的标准品，为探讨浏阳金柑果实中各类黄酮含量的变化规律，本次实验通过最大吸收波长下液相色谱峰面积对含量较高的 5 种类黄酮（3',5'-双碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黄素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黄素-6-C-新橙皮糖苷、金柑苷）在浏阳金柑各个发育时期的相对定量做了比较，，探讨了这 5 种类黄酮含量在浏阳金柑果实各个发育时期的变化规律。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S666.1;Q78

【参考文献】