羊肚菌菌核发育形态、IMV检测及原生质体融合技术研究

发布时间：2020-05-31 20:17

【摘要】：羊肚菌在生物分类上属于子囊菌门,为世界著名的食药兼用用菌,风味独特,并具有抗氧化、消炎、抗菌、免疫刺激和抗肿瘤等多种生物活性。2012年以来,羊肚菌大田栽培首次在我国四川成功实施,并快速向全国辐射。然而,与羊肚菌人工栽培快速发展形势不相称的是,羊肚菌的基础理论研究还比较落后,限制了羊肚菌产业的持续健康和稳定发展。譬如,羊肚菌菌核发育机制、菌种质量评价、育种新技术应用等研究,将促进羊肚菌生产的健康发展。本研究采用电子显微术和激光共聚焦显微术研究了羊肚菌菌核发育过程中的形态和生理变化,发现羊肚菌菌核发育涉及了自噬、凋亡和坏死等事件,羊肚菌菌核的能量储存物质为脂肪;建立了羊肚菌栽培菌株身份(identity)、交配型(mating type)和活力(vitality)的IMV检测技术,可用于羊肚菌人工栽培菌株在大生产中的适应性检验;优化了羊肚菌原生质体释放和再生技术,建立了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活融合技术,获得了一批融合菌株,对推动羊肚菌原生质体融合育种技术发展具有现实意义。主要研究结果如下:(1)对梯棱羊肚菌1号菌株,菌丝重复分枝和末端菌丝或亚末端菌丝分枝的扩大形成菌核原基,其菌核发育兼具末端型和侧生型特性,为复合型;透射电子显微术研究发现羊肚菌菌核发育涉及了自噬、凋亡和坏死事件;活细胞共聚焦激光成像研究揭示了菌核中的能量储存物质为脂质性质。脂肪的定性测定表明,菌核中积累的脂肪多于营养菌丝细胞。(2)分别采用ITS-1/ITS-4、RPB1B-F/RPB1B-R、RPB2B-F/RPB2B-R引物对实验室保存的6种羊肚菌的基因组DNA进行PCR扩增,测定了其ITS、RPB1B、RPB2B基因序列,并进行了序列比对分析。结果表明,菌株4号和XuChang为梯棱羊肚菌(Morchella importuna),菌株201、13号、SZL-3号为六妹羊肚菌(Morchella sextelata),菌株CuBing与Morchella kaibabensis同源相似性为98.9%,可信度为100%。设计和筛选了羊肚菌交配型基因测定的特异性引物,发现引物对Mat1-1/Mat1-1-1可特异性鉴定六妹羊肚菌的交配型,引物对Mat1-1-1/Mat1-2-1能够鉴定梯棱羊肚菌的交配型。采用筛选的引物对分别对测定的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的基因组DNA进行PCR扩增,发现每对引物均能扩增出1条清晰的条带,并且混合引物均能扩增出两个条带。这些结果表明,筛选的引物对可用于六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株的交配型分析,测试的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌菌株均未发生交配型缺失,六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌均属于典型的异宗结合真菌。测定了六个羊肚菌菌株的脂质过氧化水平,评价菌株的衰老情况。结果发现,菌株SZL-3和CuBing老化程度最高,菌株201、13号活力最强,菌株4号、XuChang老化程度介于二者之间。(3)对梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生质体释放条件进行了优化。结果表明,梯棱羊肚菌原生质体制备的最优条件为:稳渗剂为0.6 M甘露醇,酶液体系为2%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶,菌龄为3 d。在该优化条件下,梯棱羊肚菌原生质体产量为1×10~6个/mL,原生质体再生率可达1.8%。六妹羊肚菌原生质体制备最佳条件为:稳渗剂为0.6 M甘露醇,酶液体系为2%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶,菌龄为3 d。在该优化条件下,六妹羊肚菌原生质体产量为6.5×10~5个/mL,原生质体再生率可达1.5%。(4)优化了梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活原生质体融合条件。结果表明,2种羊肚菌种间原生质体融合的最优条件为:原生质体融合温度25℃,溶液pH 8.0,CaCl_2终浓度50 mmol/L,融合剂PEG浓度25%。在优化条件下,原生质体融合率可达0.8%。(5)筛选了鉴定2种羊肚菌的特异性RAPD(random amplified polymorphism DNA,随机扩增多态性DNA)分子标记。测定了2亲本及融合子的RAPD标记,通过聚类分析发现双亲本与融合子可分为3大类群:第一类群包括亲本梯棱羊肚菌(P1),第二类群包括所有融合子,第三类群包括亲本六妹羊肚菌(P2)。16个融合子可以分为3组,其中1、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16为一组,4、7为一组,2、3为一组。这些结果表明,采用梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌种间双灭活融合技术获得的羊肚菌原生质体融合子为真正的融合子。(6)分别选取融合子1号(R1)、融合子2号(R2)、融合子4号(R4)、和双亲本进行培养,比较每种融合子和双亲本菌株的菌落形态差异,发现梯棱羊肚菌(P1)、六妹羊肚菌(P2)、R1、R2、R4均产菌核且产量多,菌核形态均为点状;按照菌丝生长速度,各菌株的排列顺序为:R4P1P2R2R1,但5菌株生长速度相差不大;不同菌株的菌块恢复时间不同,其中P2恢复时间最长,P1恢复时间最短,1号、2号和4号融合子介于二者之间;P1、R1、R2、R4的菌丝紧密、P2稀疏;所有菌株菌落边缘均整齐。这些结果表明,2种羊肚菌的融合子为真正的融合菌株。(7)人工栽培发现,融合子R1和R4子囊果形态上接近2号亲本(P2,为六妹羊肚菌),R5和R8形态接近于1号亲本(P1,为梯棱羊肚菌),而R2和R3介于两亲本之间。(8)人工栽培表明,2亲本与6个融合子8个菌株产量之间均差异显著,没有任何融合子菌株产量超过P1亲本菌株,而R2融合子产量低于P2亲本,暗示在原生质体融合育种中,亲本的选择很重要(P2亲本已经退化和老化);也同时说明,通过原生质体融合技术获得高产菌株的局限性很大;但该技术在综合亲本其他优良性状的融合菌株选育方面具有较大潜力。
【图文】：

羊肚菌,基因位点,结构组成

郑州轻工业大学硕士学位论文E3123 和 GME3124，GME3123 含有 4 个内含子，编码 488 个氨基酸，1688bE 3124 含有 5 个内含子，编码 512 个氨基酸，1825bp。BLASTx 分析表明E3123 与 GME3124 分别与 Tuber borchii 的假定蛋白(AIU38081.1)的氨基酸为 24%，21%[40]。这些 ORFs 与先前发表的交配型基因的同源物有很大不此，我们推测它们是仅在羊肚菌中发现的新的交配基因。对梯棱羊肚importuna、六妹羊肚菌 M.sextelata 的单子囊孢子种群进行了分析，结果表 MAT1-1-1 和 MAT1-2-1 的等位位点的比例与 1:1 的比例没有显著差异。明，这两种黑羊肚菌是异源的。

示意图,羊肚菌,子囊果,交配型

迁移率基团(HMG)蛋白(MAT1-2-1)[42]。相反，同宗交配型真菌可自我在没有交配伴侣的情况下完成生殖周期。典型地，一个单一的纯合体菌个单倍体核中含有两个 MAT 基因（连锁的或非连锁的）[35, 42]。在过去，分子技术，特别是基因组测序技术的出现，为深入理解羊肚菌物种的和生殖方式铺平了道路。羊肚菌为异宗结合食用菌，也就是说，必须有 2 种不同交配型发生亲和具有 2 种交配型基因（Mat1-1-1 和 Mat 1-2-1）的菌株，才能用于人工单一交配型 Mat1-1-1 或 Mat 1-2-1）的菌株用于生产，存在较大的不出更加重要的是，羊肚菌交配型基因在羊肚菌子囊果中的分配不均一（图，也就是说，靠单孢分离和组织分离获得的菌种，存在着单一交配型基风险，这样的无效菌种用于生产，将使菇农户面临着巨大的失败风险。产菌种进行交配型检测，只将同时具有 2 种交配型的菌种用于生产，对具有重要意义。
【学位授予单位】：郑州轻工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S646.7

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