miR396在番茄果实生长发育中的功能研究

发布时间：2020-06-03 00:02

【摘要】：微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源非编码RNA,可以从转录水平或转录后水平调控其靶基因的表达,在植物的多种生理过程中发挥着重要作用。miR396作为植物中保守的一类miRNA,对于植物花器官发育、作物籽粒大小、作物产量等生理过程具有重要作用,然而miR396对于果实的生长发育、品质、产量等重要性状的作用还未被研究。本研究以番茄品种Micro-Tom为材料,对番茄中的miR396及其靶基因进行了鉴定及表达模式分析,并分别对利用短串联目标模拟(Short Tandem Target Mimic,STTM)方法抑制miR396功能的STTM396转基因番茄和超表达不同miR396靶基因的转基因番茄进行了研究,揭示了 miR396及其不同靶基因在番茄果实生长发育中的作用,主要研究结果如下:(1)对番茄中的miR396及其靶基因进行了鉴定和表达模式分析,发现miR396靶基因在幼果时期表达量高于绿熟时期果实,为研究miR396对于番茄果实的影响打下了基础。番茄中的miR396包括miR396a和miR396b,表达分析显示miR396a在番茄各组织中的表达量远远高于miR396b。番茄中miR396的靶基因主要是生长调控因子(Growth Regulating Factors,GRFs),番茄中共有13个GRFs,其中8个GRFs是miR396的靶基因,此外胞嘧啶DNA甲基化酶DRM5(Solyc02g062740)和MAD 家族的 MADS 基因(Solyc01g066730)也是 miR396的靶基因,表达分析发现miR396的这10个靶基因在番茄幼果中的表达量显著高于绿熟时期果实。(2)miR396功能抑制的STTM396转基因番茄果实及萼片显著变大,表明miR396对于番茄果实及萼片的大小具有重要的调控作用。miR396功能抑制的STTM396转基因番茄果实重量、长度、宽度、高度、心室数、表皮细胞面积、果皮厚度和萼片大小、萼片细胞面积及细胞数目都显著增加。实时定量PCR分析显示STTM396番茄果实及萼片中的miR396a和miR396b都显著下调,miR396的10个靶基因大部分上调,尤其是GRF1、GRF2、GRF3及GRF4及GRF5。(3)STTM396转基因番茄果实的转录组分析发现,miR396靶基因中的5个GRFs可能对番茄果实的生长发育具有重要作用,并且发现miR396影响细胞壁和植物激素相关基因的表达。miR396靶基因中的GRF1、GRF2、GRF3、GRF4及GRF5在STTM396番茄果实中表达值升高最明显,而miR396其他5个靶基因及果实大小和形状相关数量性状位点的表达基本没变化或表达值很低。差异表达基因主要富集到细胞壁相关条目,尤其是果胶裂解酶和果胶酯酶基因明显下调,进一步研究发现STTM396番茄果实的硬度、原果胶含量和总果胶含量显著增加,此外植物激素乙烯、生长素和赤霉素相关基因的表达也发生了显著变化。(4)超表达不同miR396靶基因GRFs后,发现miR396通过调控不同靶基因GRFs影响果实重量、心室数、光泽度、果皮厚度、萼片长度和宽度。利用桥接PCR技术,将5个GRFs分别同义突变成抗miR396剪切的rGRFs。利用农杆菌介导的番茄遗传转化技术,获得了 5种分别超表达rGRFs的rGRFs-OE转基因番茄,表型分析发现rGRF1-OE的番茄果实性状基本不变;rGRF2-OE的番茄果实光泽度变暗,果实重量减轻;rGRF3-OE的番茄果实光泽度变暗,重量基本不变;rGRF4-OE通过显著增加果皮厚度使果实重量明显增加;rGRF5-OE通过显著增加果实心室数使番茄果实重量明显增加;rGRF1-OE的番茄萼片大小基本不变,其余4种rGRFs-OE的萼片宽度都增加,但rGRF2-OE和rGRF4-OE的萼片长度基本不变,rGRF3-OE萼片长度变大,而rGRF5-OE萼片长度显著变小。综上,miR396通过调控其靶基因GRF2、GRF3、GRF4和GRF5影响了番茄果实及萼片的生长发育,本研究为miR396参与调控果实及萼片的生长发育提供了依据。
【图文】：

逦ＭＩＴＥ逡逑ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ邋ｅｌｅｍｅｎｔ逡逑图１－２植物ｍｉＲＮＡｓ的合成及ｍｉＲＮＡ基因的起源（Ｖｏｉｎｎｅｔ，２００９）逡逑（Ａ）植物ｍｉＲＮＡｓ的合成。（Ｂ）植物ｍｉＲＮＡ基因起源于反向基因重复事件。（Ｃ）植物逡逑ｍｉＲＮＡ基因起源于自然进化。（Ｄ）植物ｍｉＲＮＡ基因起源于转座元件。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡｓ邋ａｎｄ邋ｏｒｉｇｉｎｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋（Ｖｏｉｎｎｅｔ，邋２００９）逡逑（Ａ）邋Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡｓ．邋（Ｂ）邋Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ａｎ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑ｅｖｅｎｔ．邋（Ｃ）邋Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ邋ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．邋（Ｄ）邋Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ逡逑ｍｉＲＮＡ邋ｇｅｎｅｓ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ邋ｅｌｅｍｅｎｔｓ．逡逑（二）植物中ｍｉＲＮＡ的作用机制逡逑研究表明，ｍｉＲＮＡ可以通过剪切、翻译抑制或ＤＮＡ甲基化三种方式对其靶基因逡逑进行调控，即２１邋ｎｔ的ｍｉＲＮＡ主要与ＡＧ０１结合导致靶基因的剪切或翻译抑制，在逡逑转录后水平沉默靶基因，而２４邋ｎｔ的ｍｉＲＮＡ主要与ＡＧ０４结合在细胞核内引起靶基逡逑因ＤＮＡ甲基化

逦ＡＧＯ邋Ｔｕｒｎｏｖｅｒ逦Ｖａｃｕｏｌｅ逡逑图１－３植物中ｍｉＲＮＡ介导的基因沉默示意图（Ｒｏｇｅｒｓ邋ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ，邋２０１３）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｏｖｅｒｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｇｅｎｅ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋（Ｒｏｇｅｒｓ邋ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ，邋２０１３）逡逑ｍｉＲＮＡ的作用机制中，ＡＧＯ蛋白发挥着重要功能。在不同的植物物种中，ＡＧＯｓ逡逑家族的成员数量也有很大差异，如在拟南芥中存在１０个ＡＧＯｓ蛋白，在水稻中含有逡逑１９个ＡＧＯｓ蛋白，而在绿藻ＣＷｏｍ少ｃ／ｏｍｏｗｏｓ邋ｒｅ／ｗ／ｗｒａＷ中只含有３个ＡＧＯｓ蛋白逡逑（Ｒｏｇｅｒｓ邋ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ，邋２０１３；邋Ｆａｎｇ邋ａｎｄ邋Ｑｉ，，２０１６）。所有真核生物的邋ＡＧＯｓ邋蛋白都存在邋ＰＡＺ逡逑结构域和ＰＩＷＩ结构域，ＰＡＺ结构域含有寡核苷酸／寡核苷酸结合域，能够结合ｍｉＲＮＡｓ，逡逑而ＰＩＷＩ结构域含有ＲＮａｓｅＨ－ｌｉｋｅ功能，能够剪切与ｍｉＲＮＡ互补的靶基因（Ｒｏｇｅｒｓ逡逑ａｎｄ邋Ｃｈｅｎ
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S641.2


本文编号：2693971