柑橘花药和小孢子培养创制双单倍体及其分子鉴定

发布时间：2020-06-03 04:32

【摘要】：随着高通量测序技术的飞速发展,纯系以其基因组简单便于分析而备受关注。柑橘作为世界上最重要的水果之一,虽然已获得部分纯系材料,但群体较小且涉及的遗传背景较为相似,因此,扩大柑橘纯系群体的工作任重道远。柑橘广泛存在的珠心胚现象,以及童期长、基因组高度杂合等特点,使其无法通过传统的自交获得纯系。花药培养是创制柑橘纯系群体的首选技术。游离小孢子培养为直观地呈现胚离体再生过程提供可能,同时有效减轻后续筛选鉴定的工作量,该项技术已被应用于多个物种。本实验通过花药培养扩大柑橘纯系群体,并尝试柑橘游离小孢子培养;同时,对前人创制的纯系材料进行细胞学鉴定。主要结果如下:1.对柑橘9个品种进行花药培养,共再生85个胚状体,其中枳32个,墨西哥莱檬24个,早花柠檬23个,早金甜橙3个,暗柳橙、露德红夏橙、红暗柳橙各1个。其中46个胚状体生芽,部分离体嫁接于枳砧,随后移栽至温室,其它仍处于继代过程中。选取部分胚状体提取DNA,通过SSR分子标记鉴定再生胚状体的基因型,表明枳、红暗柳橙、早金甜橙均为杂合体;莱檬及墨西哥莱檬均为纯合体,所有再生植株倍性均为二倍体。花药培养过程中,比较花蕾大小、花期、低温预处理时间对花药培养再生率的影响,发现开花在12月的早花柠檬及1月的莱檬再生率明显高于3月开花的枳,而4月开花的其它6个品种的再生率更低;低温预处理7-8d,其再生率高于其它预处理。2.对10个柑橘品种进行游离小孢子培养,参考前人的培养过程稍加改良,预处理液以0.4 mol/L甘露醇为基础设置3种处理,培养基以MCM及BH_3为基础进行多种改良,培养密度设置4个梯度。对比多种处理发现,以含1%DMSO的0.4 mol/L甘露醇作为预处理液,小孢子细胞更倾向于形成类似胚状体的致密细胞团,但其它处理对小孢子细胞的再生几乎没有影响。该实验中获得的致密细胞团没有继续发育。3.对早金甜橙7个纯系愈伤组织进行染色体制片,获得部分较清晰的染色体图像,发现双单倍体愈伤较单倍体愈伤更易发生染色体加倍,这些不同纯系的染色体图像可以用于后续的纯系细胞学研究。
【图文】：

花苞,甜橙,小孢子,花药培养

取大小不同的花蕾剥取花药进行简单压片观察,用 1 %醋酸洋红或 DAPI时期的确定及花粉活力的鉴定(图 1)。通过观察细胞核的位置，，将大部分单核靠边期的花蕾大小作为重点采样对象。采集到的花蕾进行预处理，即理 3-8 d。预处理后的花蕾用游标卡尺进行大小分级，然后分别进行表面消毒，消照王淑明博士毕业论文，具体如下：1. 10% HCl 浸泡 30 s，倒出 HCl 液体；2. 50%次氯酸钠（有效氯大于 5%）浸泡 10 min，期间不断轻轻摇晃并用烤不被液体浸没的部位；3.加入无菌水清洗 3-5 次，每次浸泡 3-5 min，每次更换液体均需更换无。

过程图,游离小孢子培养,过程,甘露醇

将上述剥得的花药置于三种不同的预处理液（图2a），分别为 0.4 mol/L 甘露醇（记作 control，参照 Chiancone et al 2015a）、0.4 mol/L甘露醇加入 1%二甲亚砜（记作 1% DMSO，参照 Echavarri et al 2015）、0.4 mol/L 甘露醇代替 MT 液体培养基中的蔗糖（记作 0.4M+MT，参照 Echavarri et al 2015）中，摇床 50 r/min 黑暗处理 7 d，温度条件为 28 ℃。图 2 游离小孢子培养过程a．含 1% DMSO 的甘露醇处理 7d 的高班柚花药 b．游离小孢子培养过程中的致密颗粒 c．培养初始状态的小孢子细胞 d．培养过程中的细胞团 a-b 标尺为 1 cm c-d 标尺为 40 μm.Fig 2 Isolated microspore culture processa. ‘ Kaopan’ pummelo’s anther treated with Mannitol containing 1%DMSO for 7 days b. dense granule of isolatedmicrospore culture process c. microspore at culture initial stage d. cell mass of culture process a-b: bar= 1cm c-d:bar=40μm.7 d 黑暗处理后导出小孢子，方法参照 Chiancone 等（2015a）的报道稍作修改
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S666

【参考文献】