DkZAT2调控柿果实采后脱涩的机制研究

发布时间：2020-06-06 19:47

【摘要】：柿(Diospyros kaki)一般分为涩柿和甜柿,我国为以涩柿为主,成熟涩柿果实采后需经人工脱涩处理后才可食用。本文以6种涩柿品种('镜面柿,、'益都托柿,、'没皮柿'、'磨盘柿'、'临潼挂杆柿,、'耀县五花柿,)为实验材料,通过高浓度CO2处理(AHCA)进行脱涩,利用RNA-seq数据分析,筛选响应AHCA处理的关键转录因子,探索有效转录因子之间的相互作用机制,丰富和完善柿果实采后脱涩低氧处理的转录调控机制。主要结果如下:1.基于转录组测序,获得了参与脱涩调控的新型转录因子。以在AHCA处理下快速脱涩的'镜面柿'为材料,开展了 RNA-seq分析。以差异基因表达量(AHCA处理1d的FPKM绝对值)大于50和差异表达倍数(AHCA处理1 d/CK 1d)大于5为筛选标准,筛选获得了 23个脱涩相关转录因子。通过双荧光素酶体系分析,筛选得到的转录因子DkERF29、DkZAT2、DkASR1能够转录激活脱涩关键靶标基因DkPDC2的启动子。且DkERF29是目前发现的对DkPDC2启动子具有最强调控效应的转录因子,达到6.51倍。并进一步通过EMSA体系明确了 DkERF29的结合位点为DkPDC2启动子序列上的GCC-box序列。柿果实圆片瞬时表达发现,相比对照,DkERF29、DkZAT2、DkASR1的瞬时过量表达均可显著降低柿果实圆片中可溶性单宁含量。2.脱涩调控转录因子间协同效应分析。本文筛选得到的DkERF29、DkZAT2、DkASR1和前期报道转录因子DkERF9、DkERF19,均可有效调控DkPDC2启动子,因此本研究进一步分析了以上转录因子间的协同效应。双荧光素酶结果分析显示DkERF29能分别与DkERF19和DkZAT2对DkPDC2启动子产生协同增强效应。通过BiiFC体系验证DkERF29与DkERF19和DkZAT2均存在蛋白-蛋白互作关系。3.脱涩相关转录因子在5个涩柿品种中的表达分析。选取5个对AHCA采后脱涩处理存在响应差异的品种,发现DkZAT2的基因表达在这5个品种间呈现明显的规律性。在响应AHCA处理(即在AHCA处理下果实快速脱涩)的品种中,DkZAT2的基因表达明显受处理上调;在不响应AHCA处理(即在AHCA处理下无法快速脱涩)的品种中,DkZAT2的基因表达上调有限。进一步验证以上5个转录因子对氧气的响应能力,在常氧条件下检测0-8天的基因表达情况,发现DkErf29的表达平均要高于其他转录因子,而dKzat2基因基本无表达。因此推测,DkZAT2是脱涩过程中的低氧信号响应主要转录因子。综上所述,本文推测在柿果实采后脱涩过程中,存在“信号响应”和“调控处理”两类转录因子。在低氧处理条件下,实现“信号响应”的DkZAT2等转录因子能快速响应低氧条件,并向下游传递低氧信号,通过与DkERF29结合,放大转录调控信号,促进DkPDC2基因表达,生成低氧代谢产物乙醛,完成采后脱涩。
【图文】：

逦３结果与分析逡逑于对照１山差异上调基因３４６１个，差异下调基因３５３１个（图３．２ａ）。对两组逡逑差异分析结果进一步分析，发现有共同差异上调基因２３６９，共同差异下调基因逡逑２６６０个（图３．２ｃ）。通过ｆＴＡＫ分析

１７３个共同差异上调转录因子展开进一步的筛选。以差异基因表达量（转录因子逡逑在ＡＨＣＡ处理Ｉｄ的ＦＰＫＭ绝对值）和差异表达倍数（转录因子在ＡＨＣＡ处理逡逑１邋ｄ相较于ＣＫ邋Ｉｄ的上调倍数）为两个维度（图３．３），将共同差异上调转录因逡逑子中基因表达量大于２０，差异表达倍数大于２倍的９４个转录因子细分为４２组。逡逑本实验以ＦＰＫＭ大于５０，差异表达倍数大于５作为最终筛选标准（图３．３）。筛逡逑选得到４３个转录因子，其中１０个转录因子已发表，本实验新克隆得到２３个转逡逑录诅子，，包括邋ＤｋＥＲＦ２９／３０／３１、ＤｋＧＬＫｌ／２、Ｄｋｔｒｉｈｅｌｉｘｌ、ＤｋＧＲＡＳｌ／２／３、ＤｋＺＡＴｌ／２、逡逑ＤｋＡＳＲｌ、ＤｋｂＨＬＨ３／４、ＤｋＷＲＫＹ８／９／Ｉ０、ＤｋＮＡＣ１０／ｌＩ、ＤｋＨＳＦ２、ＤｋＭＢＦｌ、ＤｋｂＺＩＰ６逡逑和并构建于ＳＫ载体中。通过双荧光素酶体系发现拉？逡逑和能够显著诱导启动子活性，诱导倍数分别徶到６．５１倍、２．０２逡逑倍和２．０２倍，对启动子的诱导倍数为２．０２倍（图３．４）。逡逑３．４邋ＺＷｔ五及尸２９、、ＺＷｔＡＳｉＷ在柿果实圆片中瞬时过董表徸分逡逑析逡逑进步一对验证得到具有调控效应的转录因子逡逑进行圆片瞬时过量表达分析。选取对照载体ＳＫ邋（即未进行基因构建的ＳＫ空载逡逑体）作为对照，三个转录因子Ｚ）々Ｚ４ｒ２、￡＞以R%７）侵染后的柿果实逡逑圆片中
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S665.2

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本文编号：2700171