两种农杆菌介导的转基因方法在草地早熟禾中的应用

发布时间：2020-06-09 02:40

【摘要】：本研究旨在探寻农杆菌介导草地早熟禾不同受体材料的转基因方法,分别采用以农杆菌侵染草地早熟禾胚性愈伤组织和农杆菌浸种法两种,通过两个植物二元表达载体(pTCK303-PpGBF1、pTCK303-PpGAMT1)转入两个外源基因,获得了转基因植株。对这两种遗传转化方法进行详细比较,实验主要的研究成果如下:1、在农杆菌浸种法转化草地早熟禾成熟种子的实验中,使用重悬后OD 600为0.9的菌液,加入三种不同的侵染受体真空处理3min,100rpm低速摇床震荡10min,转移到垫在培养皿里的湿润滤纸上黑暗培养3d。在滤纸上用筛选液筛选30d,移栽绿苗入土,壮苗30d后提取总DNA进行PCR鉴定。结果显示,侵染剪掉新芽的种子,农杆菌转化的PCR鉴定阳性率较高。PCR 阳性植株共39株,转化周期为3个月。2、在以早熟禾胚性愈伤组织为转化受体的转化研究中,得出OD 600为0.3,侵染时间为15min,和OD 600为0.6,侵染时间为10min,的组合侵染效果最好,可观察到侵染后愈伤组织有新生的组织长出,且无农杆菌过度生长的情况,最终得到转基因阳性植株2株,转化周期为8个月。本研究构建了草地早熟禾巴润的农杆菌介导胚性愈伤的转化体系,探索了对农杆菌浸种法在草地早熟禾的可能性。实验表明浸种法可以缩短转化时间,对本领域的研究具有一定的价值。
【图文】：

９｜逡逑９Ｈ逡逑图２．１早熟禾Ｂａｒｏｎ邋ＲＮＡ提取凝胶电泳检测图像逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ邋Ｂａｒｏｎ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｉｍａｇｅ逡逑从ＲＮＡ的电泳图像可以看出，ＲＮＡ由三条带组成，条带分明且清晰，可逡逑以进行下一步实验。逡逑２．１．３．２草地早熟禾基因的克隆逡逑实验根据ＡＧＪＭ７７基因序列及草地早熟禾前期转录组分析数据设计的引逡逑物，以反转录得到的ｃＤＮＡ为模板，扩增ＰｐＧＭＭｎ基因片段，琼脂糖凝胶电泳逡逑检测显示，引物对ＧＡＭＴ１－Ｆ１／Ｒ１克隆出的条带单一，长度和预测相符，为逡逑１１４０ｂｐ，如图邋２．２。逡逑Ｍ邋ＰｐＧＡＭＴＩ逡逑卜逡逑图２．２邋／＾ＧｄＭ７７基因克隆凝胶电泳图像逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋ＰｐＧＡＭＴＩ邋ｇｅｎｅ邋ｃｌｏｎｉｎｇ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃ

电泳检测长度，如下图。将使电泳条带长度正确的菌液送睿博兴科公司测序，将逡逑测序结果比对后让公司返回菌液和质粒，质粒用冻融法转化农杆菌ＧＶ３１０１，，挑逡逑单菌落进行菌落ＰＣＲ检测，电泳鉴定，如图２．３，选择使电泳条带大小正确的菌逡逑液加等体积５０％甘油保存，存放在－８ＣＴＣ冰柜保存。逡逑２０００ｂｐ＿逦？逦二，＊邋Ｊ逡逑ｌＯＯＯｂｐ邋、逡逑图邋２．３邋ＧＶ３１０１－ｐＴＣＫ３０３－／＾（＾ＩＭ７７邋菌液邋ＰＣＲ邋鉴定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋ＰＣＲ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＶ３邋ｌＯｌ－ｐＴＣＫＳＯＳ－Ｐ／＾Ｇ＾Ｍｒ／邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ逡逑２．２农杆菌浸种法转化草地早熟禾逡逑２．２．１实验材料及试剂逡逑２．２．１．１植物材料逡逑草地早熟禾巴润种子来源于北京正道生态科技有限公司。逡逑２．２．１．２质粒和菌株逡逑含有质粒的农杆菌ＧＶ３１０１菌株，来源于前期实验。逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S688.4

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