红花草莓花色相关miRNA的鉴定与分析

发布时间：2020-06-13 19:18

【摘要】：红花草莓(Red-flowered strawberry)是草莓家族的新成员,为属间杂种,其红花性状是由开红花的沼委陵菜(Potentilla palustris)利用远缘杂交的方式导入至白花栽培草莓(Fragaria×ananassa)中去的。相比传统栽培草莓而言,红花草莓不仅具有丰富的营养价值,而且具有良好的观赏价值。其花红果艳,能够应用于园林绿化和盆栽观赏,是一种新型的兼具观赏和食用的草莓,具有很好的发展潜力。花青素苷是红花草莓得以呈现红色的物质基础,本研究以红花草莓品种‘四季红’为试材,选取了红花草莓花瓣发育过程中具有明显颜色变化的三个发育时期,即蕾期(PF_L)、转色期(PF_Z)、大蕾期(PF_D)的花瓣样品,构建了9个小RNA文库(PF_L1、PF_L2、PF_L3、PF_Z1、PF_Z2、PF_Z3、PF_D1、PF_D2、PF_D3)和1个混合样品的降解组文库(PF)。通过应用高通量测序技术挖掘参与红花草莓花瓣发育过程中的miRNAs,重点发现能够参与花青素苷生物合成调控的miRNAs。利用TargetFinder软件及降解组测序技术对红花草莓小RNA测序获得的miRNA进行靶基因的预测和验证。此外,通过应用geNorm和NormFinder等程序对qRT-PCR定量的结果进行分析,筛选出适合用于红花草莓miRNA表达水平相对定量的表达稳定的内参基因,为红花草莓花色相关miRNAs的进一步研究奠定基础。主要结果如下:(1)9个小RNA文库(PF_L1、PF_L2、PF_L3、PF_Z1、PF_Z2、PF_Z3、PF_D1、PF_D2、PF_D3)通过小RNA测序技术得到的原始Total reads数分别为1.70×10~7、1.59×10~7、1.47×10~7、1.27×10~7、1.27×10~7、1.46×10~7、1.18×10~7、1.26×10~7和1.32×10~7条。共鉴定到1,703个miRNAs,其中665个miRNAs在9个样品小RNA文库中均存在。在3个不同发育时期的花瓣中共鉴定到317个显著差异表达的miRNAs,其中有127个miRNA的差异程度达到了极显著水平。(2)通过降解组测序,在PF文库得到2.37×10~7条原始reads。当去除掉3'接头序列后,发现PF降解组文库中可以匹配到草莓基因组上的reads为2.34×10~7条,目前草莓已注释的转录本数量为39,487个,降解组文库PF能够匹配到草莓已注释转录本数为34,202个,占已注释草莓总转录本的比例为86.26%。应用TargetFinder软件进行miRNA的靶基因预测,结果显示1365个miRNA对应的14,406个靶基因。利用Cleaveland软件对降解组测序数据与转录组数据进行降解位点的检测,共检测到了166个miRNA对应的227个靶基因发生降解。进一步分析发现,在miRNA-靶基因对中,有超过80%的miRNA对应多个靶基因,单个miRNA对应靶基因的数目从2到26个不等,只有12个miRNA分别只对应1个的靶基因。此外,还发现普遍存在单个靶基因受控于多个miRNA调节的情况。这表明miRNA与靶基因之间存在着复杂的调控网络。(3)应用geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对8候选miRNA的内参基因进行稳定性评价。3款软件评价结果表明,mdm-miR11004是红花草莓花色相关的miRNA实时荧光定量的最适候选内参基因,bdi-miR159a是在红花草莓所有组织样品中表达最不稳定的内参基因。(4)通过对miRNA、转录组和降解组测序数据进行联合分析,初步筛选得到了33个和红花草莓花色形成相关的候选miRNAs和其对应的40个靶基因。并选择了8个花色相关的候选miRNA在不同颜色红花草莓花瓣中进行qRT-PCR表达特性分析。初步获得了可能通过负调控的模式参与到花色的调控中2个miRNA及其对应的靶基因,即mdm-miR159d与靶基因NCL1和csi-miR156f-p5与靶基因SPL13和MYB44。这2个miRNAs在红花草莓花青素苷的生物合成中可能具有重要的作用。
【图文】：

图 1 花青素苷的生物合成途径及关键节点（戴思兰 等，2016）CHS：查尔酮合成酶；CHI：查尔酮-黄烷酮异构酶；F3′5′H：类黄酮-3′5′-羟基化酶；F3′H：类黄酮-3′-羟基化酶；F3H：黄烷酮-3-羟基化酶；FLS：黄酮醇合成酶；DFR：二氢黄酮醇-4-还原酶；ANS：花青素苷合成酶；ANR：花青素苷还原酶；LAR：无色花青素苷还原酶；GT：糖基转移酶；AT：酰基转移酶；MT：甲基转移酶Fig. 1 The biosynthetic pathway of anthocyanins and key nodesCHS: chalcone synthase；CHI: chalcone isomerase；F3′5′H: flavonoid-3′5′-hydroxylase；F3′H: flavonoid-3′-hydroxylase；F3H: flavanone 3-hydroxylase；FLS: flavonol synthase；DFR: dihydroflavonol 4-reductase；ANS: anthocyanin synthase；ANR: anthocyanidin reductase; LAR: leucoanthocyanidin reductase; GT: glycosyl transferases；AT: acyl transferase；MT:methyl transferase1.1.3 调控植物花青素苷合成的结构基因随着分子生物学以及高通量测序技术的快速发展，多种参与植物类黄酮代谢途径的相关结构基因逐渐被克隆。目前已经发现 CHS、CHI、F3H、FLS、ANS 和 DFR 等多种主要参与花青素合成的结构基因。Li et al.（2001）认为 PAL 和 CHS 在草莓果实成熟过程中没有很大的变化，，而 CHI 和 DFR 在果实着色时表达量大量增加。但是也有资料报

沈阳农业大学硕士学位论文2 材料与方法2.1 试验材料试材来源于沈阳农业大学草莓资源圃，课题组自育的红花草莓品种‘四季红’，花红色（N57 A），具四季开花习性（图 2）。根据萼片和花瓣形态特征，将花瓣发育过程划分为 5 个不同阶段（表 1，图 3），选取了红花草莓花瓣发育过程中具有明显颜色变化的三个发育时期，即蕾期（PF_L）、转色期（PF_Z）、大蕾期（PF_D）的花瓣样品用于RNA的提取以及后续的miRNA和降解组的测序，每个处理设置3次生物学重复每个重复取样从苗龄且长势一致的 50 株红花草莓品种‘四季红’植株进行。取样时间为 2017 年 12 月至 2018 年 3 月，不同组织部位的样品和不同花色样品分别取自‘四季红’的叶片，茎、果实及果柄和粉公主 ×俏佳人的杂交后代盛花期花瓣，用于内参筛选及高通量测序验证，取样后用液氮迅速冷冻，置于-80 ℃贮藏备用。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S668.4

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本文编号：2711617