基于AS-PCR鉴定枇杷S基因型及‘早黄’自交亲和机制的研究

发布时间：2020-06-17 05:00

【摘要】：枇杷是一种亚热带常绿果树,属于蔷薇科,苹果亚科植物。自交不亲和是一种普遍的遗传控制机制,广泛存在于被子植物中,它可以促使花柱拒绝自身的花粉,从而阻止近亲繁殖。自交不亲和受单一位点上(S-locus)的复等位基因(S-allele)控制,但在不同植物中的遗传控制机制并不一致。主要分为配子体自交不亲和与孢子体自交不亲和。枇杷与苹果,梨相同,属于典型的配子体自交不亲和树种。然而,就目前而言,对于枇杷自交不亲和的研究相对较少。本文通过已知的9个枇杷S-RNase基因,设计了 9对扩增S基因的特异性引物,建立了 S等位基因特异性扩增体系,利用这9对引物首次鉴定了 28个枇杷品种的基因型,重新鉴定了 11个已知基因型的枇杷品种的基因型;此外,对亲和枇杷品种'早黄'枇杷进行了自交亲和机制的初步研究;扩增了部分枇杷品种的花粉SFB基因,对其进行了进化分析。主要研究结果如下:1、根据已经鉴定的13个枇杷S-RNase基因,选择其中9个S-RNase基因(S2-RNase,S6-RNase,S7-RNase,S8-RNase,S9-RNase,S10-RNase,S11-RNase,S12-RNase,S13-RNase),并基于这9个S-RNase的序列设计了相对应的9对S等位基因特异性引物。利用已知基因型的8个枇杷品种对设计的9对引物进行了特异性的检测,发现这9对引物均能扩增出相应的S-RNase,成功的建立了 S等位基因特异性扩增体系。并且利用这9对引物首次鉴定了 28个枇杷品种的基因型,对之前研究过的11个品种的基因型进行了重新鉴定。将本研究中鉴定的11个枇杷品种的基因型与之前鉴定的结果相比较,发现这11个品种中有8个品种的基因型与之前研究中的鉴定结果一致,进一步的证明了 9对特异性引物能够有效且特异的扩增相应S-RNase基因,并且能够被用来快速鉴定含有这9个S-RNase基因的枇杷品种的基因型。2、在已知'早黄'枇杷和'白玉'枇杷的基因型(S2S10)一致的情况下,通过4组田间授粉实验,发现:'早黄'枇杷自交,有子代产生:'白玉'枇杷自交,没有子代产生;在以'早黄'为父本,'白玉'为母本时,有子代产生,而以'早黄'为母本,'白玉'为父本时,有子代产生,我们确定了'早黄'枇杷为自交亲和品种,'白玉'枇杷为自交不亲和品种,且'早黄'枇杷自交亲和的发生与花柱和花粉的S基因有关。然后,根据克隆的S2-RNase与S10-RNase基因的部分序列,设计了两对荧光引物,对这两个枇杷品种中S2-RNase基因与S10-RNase基因表达量进行了分析,发现'早黄'枇杷中S10-RNase基因的表达量远远低于'白玉'枇杷中S10-RNase基因的表达量。进一步的,利用Tail PCR对了两个枇杷品种中S10-RNase基因的全长和启动子进行了克隆。通过序列比对后发现,两个枇杷品种的的S10-RNase基因的编码区及内含子区的序列完全一致。然而,与'白玉'枇杷不同的是,在'早黄'枇杷中S10-RNase基因的启动子在ATG上游1755bp的位置缺失了 52个bp的碱基序列。基于上述结果,我们推测,'早黄'枇杷之所以表现为自交亲和是由于花柱S10-RNase基因的启动子失去了的功能,无法启动S10-RNase基因的表达,致使S10-RNase丧失了识别并降解自身花粉RNA的功能。3、利用已知的扩增枇杷花粉SFB基因的引物D-SFBF1和D-SFBR1,对8个枇杷品种花粉SFB基因进行克隆和测序分析,成功获得了 8个新的SFB基因(SFB13～SFB20)。测序结果表明,枇杷与李属植物不同(一个品种只含有2个SFB基因),一个品种的枇杷含有多个不同的SFB基因,且SFB基因的序列相似性较S-RNase基因来说较高,更为保守。不同SFB基因在不同的品种中存在的频率存在较大差异,其中SFB2出现在了 6个枇杷品种中,SFB20只出现在'宁海白'枇杷中。将得到的8个新的SFB基因进行蛋白质功能分析,发现花粉SFB蛋白主要是参与氨基酸的生物合成,合成辅助因子,脂肪酸代谢,且SFB13,SFB17,SFB20均具有裂解酶的功能。经过同源性分析,进化树构建之后,发现枇杷的SFB基因主要分为三大类,其中第Ⅲ类SFB基因与第Ⅱ类SFB基因的同源性较高,而第Ⅰ类中的SFB基因同源性较低,为69%。根据这些结果,推测出在枇杷属植物中可能由多个SFB基因一起控制花粉S决定因子的特异性,协同识别非自我的S-RNase基因。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S667.3
【图文】：

图２－１邋９对特异引物在基因中的相对位置。左边为Ｓ等位基因的名称和ＰＣＲ扩增片段的逡逑长度，箭头的位置为引物结合的位置。逡逑Ｆｉｇ２－１．邋Ｔｈｅ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋９邋ａｌｌｅｌｅ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｐｒｉｍｅｒ邋ｐａｉｒｓ．邋Ｔｈｅ邋ｎａｍｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｓ邋ａｌｌｅｌｅ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｃｔｅｄ邋ｓｉｚｅｓ邋ｏｆ逡逑ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ．邋Ｐｒｉｍｅｒ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅｓ邋ａｒｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｂｙ邋ａｒｒｏｗ邋ｈｅａｄｓ．逡逑

利用８个已知基因型的枇杷品种（附表２－２邋）来检验９对Ｓ等位基因特异性引物的逡逑特异性。由于不同引物对的ＧＣ含量不同，因而在ＰＣＲ扩增时，对应的退火温度也不逡逑同，范围在５６°Ｃ￣６２°Ｃ之间。结果发现（如图２－２）：逡逑（１）逦ＥｐｆＦ／Ｒ在退火温度为５８°Ｃ时，只在‘白玉’枇杷（Ｗｆｌ）中能扩增出对逡逑应的片段，大小为４１７ｂｐ，而在其他的枇杷品种中没有扩增出条带；逡逑（２）邋ＥｐＳ＾Ｆ／Ｒ在退火温度为５８°Ｃ时，在‘红灯笼’邋（５＾）和美国种中逡逑获得了正确的片段，大小为２２２ｂｐ，且没有非特异条带的出现，而在其他品种中没有逡逑扩增出相应的条带；逡逑（３）逦ＥｐｆＦ／Ｒ在退火温度达到６２°Ｃ时，成功的在‘冰糖种’邋（Ｓ３＂）和‘青种’逡逑（Ｗ３）中扩增出大小为２４７ｂｐ的片段，且条带单一。在其他品种中没有得到条带；逡逑（４）逦Ｅｐ５？Ｆ／Ｒ在退火温度为５８°Ｃ时，在以８个枇杷品种的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ逡逑扩增后

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本文编号：2717110