苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因GcVIR1的克隆及功能分析

发布时间：2020-06-19 20:28

【摘要】：近几年,苹果一种重要的新病害——苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot of apple),在我国苹果主产区连年大发生,给苹果产业带来巨额损失。目前,关于该病害的研究主要集中在病原学、病害发生规律和防治方法,而关于病原菌致病的分子基础研究较少。本研究开展了苹果炭疽叶枯病菌致病机理研究,旨为该病害防治的新途径、新方法提供线索。本研究首先对T-DNA插入突变体库中的部分转化子进行培养性状观测,获得与野生型菌株培养性状差异较大的菌株7株。其中突变体M22和M178的产孢量为野生型的10倍,突变体M17和M44失去了产孢能力,其他3株突变体的产孢量约为野生型的1%。致病力测定结果表明,7株突变体的致病能力均有下降,其中M44和M285完全失去了致病能力。Southern blot分析结果显示,7株突变体基因组中的T-DNA均是单拷贝插入。为分离因T-DNA插入受到影响的基因,本研究运用hiTail-PCR技术,并对PCR产物进行克隆测序,获得了T-DNA插入点的右翼序列,经与围小从壳菌菌株23基因组比对分析,获知突变体可能受到影响的基因分别为GcRRN3,GcRXT2,GcGD1,GcCON3,GcOPT2,GcMRP1和GcVIR1。为进一步鉴定候选基因,本研究采用RT-PCR技术对7个候选基因的转录情况进行了检测,7个基因在野生型菌株W16中均能扩增出单一条带,然而在各自突变体中无条带出现,表明7个候选基因在各自突变体中转录受到抑制。本研究其次对GcVIR1基因进行了深入分析。该基因全长1686 bp,不含有内含子,编码562个氨基酸。为进一步明确GcVIR1基因的功能,本研究构建了GcVIR1基因恢复载体,并借助农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT)成功将GcVIR1基因转入GcVIR1突变体M285基因组中,获得了GcVIR1基因恢复菌株R-GcVIR1。表型测定结果显示,恢复菌株R-GcVIR1完全恢复了GcVIR1突变体M285的表型缺陷。为了确定GcVIR1蛋白的亚细胞定位,我们构建了GcVIR1-RFP融合表达的GcVIR1恢复菌株R-VIR1RFP。荧光显微镜下检测结果表明,GcVIR1分布于细胞质中。为明确GcVIR1在该菌中的时空表达模式,本研究利用q RT-PCR技术检测了GcVIR1在菌丝、分生孢子、芽管和附着胞的表达量,结果显示,GcVIR1在苹果炭疽叶枯病菌各个发育阶段都有表达,在分生孢子中相对表达量最高。胶胞炭疽菌通过分泌果胶酶(聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和果胶酸酯裂解酶),克服寄主细胞壁中的果胶,使其成功在寄主体内定殖。在本研究中,GcVIR1突变体失去了致病能力,因此我们利用qRT-PCR技术检测了果胶酶合成相关基因PG1、PG2、pnl-1、pnl-2和pelB在突变体M285中的表达情况。结果显示,PG1基因表达量升高至5.89倍,PG2基因表达量升高至4.58倍,其他3个基因与野生型菌株无差异。表明GcVIR1负调控PG1和PG2基因的表达。在胶孢炭疽菌中,由附着胞调节的侵入方式在其致病过程中起到重要作用,而丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联信号途径中相关基因CMK1、CPK1、MEK1和MAF1被证实在这一过程中起到重要的调控作用。考虑到GcVIR1突变体失去了产生附着胞的能力,本研究利用qRT-PCR技术检测了这些基因在突变体M285中的表达情况。结果显示,CMK1、CPK1、MEK1和MAF1在突变体M285中表达量(与野生型相比)无明显变化,因此,推测GcVIR1基因在功能上可能位于CMK1、CPK1、MEK1和MAF1基因的下游。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.611.1
【图文】：

形态建成,炭疽病菌,致病性,信号转导途径

然 cst1 基因是 CMK1 下游的潜在功能基因，但 CST1 功能还有待于更加深入的研究。另一个 MAPK 蛋白激酶级联信号通路基因 MAF1 与酿酒酵母 Mpk1 基因同源(Kojima et al.,2002)。尽管 MAF1 基因突变菌株生长形态正常，但其致病力是明显减低的。MAF1 基因突变菌株产生细长的分生孢子，分生孢子在寄主表面及载玻片上均不能够形成附着胞，说明 MAF1 基因在附着胞形成过程中发挥重要功能(Hiruma et al., 2010)。与 MAF1 突变体不同的是，cmk1 突变体不能形成正常的附着胞，但能形成膨大的附着胞类似结构。因此，MAF1 在附着胞早期分化过程中发挥重要功能，而 cmk1 在附着胞成熟过程中发挥重要功能。虽然 CMK1 和 MAF1 基因参与炭疽菌致病性，但是另一个MAPK蛋白激酶级联信号途径基因OSC1被证实是致病性非必需的(Kojimaet al., 2004)。OSC1 敲出突变体对高渗透压敏感，并且增强了抗药性，说明 OSC1 基因参与对渗透压及农药敏感性的应答反应。与 MAPK 蛋白激酶信号通路类似，cAMP 信号通路也参与孢子萌发及侵染相关形态建成过程(Takano et al., 2001)。蛋白激酶 A(PKA)催化亚基基因 CPK1 和腺苷酸环化酶基因 CAC1 是炭疽菌致病性必需的(Yamauchi et al., 2004)，并且 CPK1 和 CAC1 基因缺失突变体孢子萌发受阻，这一结果揭示这 cAMP 信号途径参与孢子萌发过程的调控。此外，CPK1 和 CAC1 突变体在寄主内的侵染生长是有缺陷的。相反，RPK1 突变体的孢子萌发及侵染生长不受影响。以上结果说明 cAMP蛋白激酶信号通路是炭疽菌孢子萌发及侵染生长所必需的。

菌落形态,叶枯病,生长形态,突变体

生型菌株 W16 和突变体分别接种在 PDA 培养基上，25°C 黑暗培养 8 d 后观察菌图 2.1）显示：与野生型菌株 W16 相比，7 个突变体出现不同程度的白化且菌丝稀NA 的插入影响了 7 个突变体的菌落形态。 PDA 培养基上培养 8 d 后，调查突变体及野生型菌株的菌落直径，由表 2.1 可以看株菌落直径达到 8.5 cm，突变体生长速度均有不同程度的下降，M44 和 M163 菌落，分别为 7.5 cm、7.6 cm；M17、M22、M178、M183 和 M285 生长速度下降明显别为 4.8 cm、4.4 cm、5.8 cm、6.7 cm、3.5 cm。突变体产孢量的分析结果表明，野生型菌株每皿能够产生5×106个分生孢子；M22产孢量明显增加，产孢量分别为 3.6×107/皿、5.8×107/皿；其余菌株的产孢量明的产孢量为 5.0×104/皿，M163 产生 2.3×104/皿，M17、M44 和 M183 丧失了产孢了检测 T-DNA 标签插入对突变体致病力影响，本研究采用离体叶片接种孢子悬浮菌株 W16 及 7 个突变体进行了致病力分析。由表 2.1 可以看出，与野生型菌株相比病力均有不同程度的降低。W16(对照菌株)在接种叶片 3d 后，在叶片上形成直径为，突变体 M178 致病力少稍有下降，形成的病斑直径大小为 0.94 cm；突变体 M17、和 M183 致病力下降明显，病斑直径分别为 0.50 cm、0.32 cm、0.34 cm、0.12 cm； M285 对叶片均丧失了致病能力，未形成病斑。

【参考文献】