光照强度对葡萄果实品质及花青苷合成的调控机理研究

发布时间：2020-06-21 22:50

【摘要】：花青苷是葡萄中很重要的次生代谢产物,是红葡萄酒中主要的呈色物质,对红葡萄酒的颜色起着决定性作用,同时花色苷还可与其他物质(如单宁)结合,进而影响葡萄酒的口感,从而对葡萄酒的品质产生重要的影响。目前,葡萄果皮中不同种类花青苷对光照强度的响应机制还不清楚,完全遮光时花青素的合成及调控基因表达模式还不明晰。本研究以酿酒葡萄‘马瑟兰’为试材,采用4种不同透光性(A:50%;B:15%;C:5%;D:0)的果袋对花后45d的果穗进行套袋,以不套袋果穗作为对照(CK)。分别在花后90d(S1)、花后100d(S2)和花后125d(S3)取样,采用GC-MS、LC-MS及RNA-seq技术对不同时期的样品进行了测定和分析。主要结果如下:1.遮光果实中总酚和花青素含量显著降低,果袋透光率小于50%时单宁和类黄酮物质的合成被显著抑制;套袋增加了果实中酒石酸、苹果酸和乳酸含量,并在S3时和对照差异最大。不同处理影响果实中香气物质的合成与积累,随光照强度的减弱,成熟果实中脂肪酸代谢和异戊二烯代谢途径合成的芳香物质种类和总量减少;D减少了氨基酸代谢合成的芳香物质种类,其他处理和CK一致,芳香物质总量在遮光果实中显著降低。除庚醇、顺式-7-癸醛和反式-己烯醛含量在遮光果实中显著增加外,其余芳香物质在果实遮光后含量降低。2.转录组测序结果显示,在S2时,随果袋透光率的减小,下调的基因从502个增加到1482个,上调基因从721个增加到2308个;在S3时,随着光照强度的降低,下调基因从1592个增加到2429个,上调基因从1326个增加到1599个。GO富集结果显示,在生物学过程分类中,上下调基因数目最多的生物学过程为代谢过程、细胞过程、单一生物过程和刺激响应;细胞组分分类中差异基因数最多的是细胞区域、细胞、膜相关和细胞器;分子功能分类中上下调基因数量最多的是催化活性和结合。KEGG富集结果表明,不同处理差异表达基因主要参与类黄酮合成、植物昼夜节律、芪类、二芳基庚醇和姜醇的生物合成及苯丙氨酸代谢等通路。挑选类黄酮和脂肪酸代谢途径中的14个候选基因进行q RT-PCR分析,结果显示,除PAL(VIT_08s0040g01710)在A1中表达水平的变化趋势和转录组数据不一致外,其他基因均和转录组测序数据结果一致。3.果袋透光率减小,延迟了果实的转色时间。A和CK的果实几乎同时开始转色,B的着色时间比CK晚3d,C和D处理延迟了10d;果实总花青素浓度在3个发育阶段均随果实袋透光率的降低而降低,其中A、B、C和D在采收期分别比CK下降10.10%、19.23%、37.07%和51.50%。采用UHPLC-MS/MS在CK和D在成熟果皮中分别检测到24种和21种花青苷组分,Malvidin-3-O-coumaroylglucoside(trans)含量随光照强度的增加而增加,完全遮光时不能合成,属于光诱导型花青苷类型;其它花青苷的含量与光照强度变化无显著的相关性,Malvidin-3-O-coumaroylglucoside(cis)和Malvidin-3-O-acetylglucoside在完全遮光果皮中分别占总花青苷含量的14%和34%,对照果皮中分别占总花青苷含量的1%和27%,是非光诱导型花青苷的典型代表。光诱导型和非光诱导型花青苷的合成通过类黄酮合成途径中的功能基因及MYB、bHLH等转录因子进行调控。4.对葡萄bHLH基因家族成员进行生物信息学和不同生育期果实中的表达水平进行了分析。葡萄b HLH中的96个成员被分成了6个亚族,外显子数目在1-11个之间,第Ⅴ亚族外显子数目总体较多,第Ⅲ亚族成员外显子数目较少;葡萄b HLH家族分布于除9号染色体之外的其他所有染色体上,氨基酸数目在136-573个之间,分子量大小范围为15249.69D至64156.59D,等电点在4.65至10.37之间,除GSVIVT01034621001外均为疏水性蛋白;大多数VvbHLH家族成员主要定位于细胞核中,二级结构以无规则卷曲为主;芯片数据分析表明,该家族成员在不同生育期及不同组织的表达具有特异性,大多数基因在果实转色开始后表达上调。qRT-PCR表明,‘马瑟兰’葡萄在转色期VvbHLH家族成员表达水平上调显著。5.克隆得到了葡萄VvMYB30、VvbHLH79和VvbHLH121并成功构建了过表达载体。农杆菌介导的苹果果皮瞬时表达分析发现,注射转化农杆菌的苹果果皮在光照条件下能够着色,花青苷含量增加,黑暗时果皮不能着色。q RT-PCR检测发现着色部位果皮中Vv MYB30、Vvb HLH79、Vvb HLH121和花青苷合成相关功能基因(CHS、CHI、F3H、DFR、LDOX和F3’5’H)的表达水平不同程度上调。洋葱表皮亚细胞定位发现,3个基因均定位于细胞核中,与生物信息学预测结果一致。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S663.1
【图文】：

图 1-1 花青苷的生物合成途径Figure 1-1 Biosynthetic pathways of anthocyanins2.2 花青苷的修饰花青素的糖基化修饰通常是由定位在细胞质的糖基转移酶来催化的，最常见的和花青素结合的单糖依次是葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖。C3端的糖基化过程发生在所有自然合成的花青素上，以此增加色素的稳定性（Mazza et al., 1987）。糖基化使花青苷的颜色向红色转变，花青素 3-生物苷中的普通糖有芦丁糖（葡萄糖加鼠李糖）、苦参糖（葡萄糖加葡萄糖）和桑树糖（葡萄糖加木糖）（Bego a et al., 1999；Ka¨hko¨nen et al., 2003），3-生物苷通常比花青素单苷更稳定（Luo et al., 2007）。糖基转移酶 1 家族能够将糖残基加入花青素不同位置，花青素中 3，5 二糖苷也是比较常见的，与花青苷苷元相比，3 位糖基化显著提高了花青素苷元的稳定性，而 5 位糖基化苷元可能降低花青素的稳定性

图 2-1 GC-MS 总离子质谱图Figure 2-1Total ion mass spectrogram of GC-MS1.4 数据处理用 Origin 9.0 软件对数据进行整理和作图，用 SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计分析，采用最小显著差异法（LSD）比较不同数据组间的差异，显著性水平设定为 α=0.05。2 结果与分析2.1 光照强度对葡萄果实单宁、多酚、类黄酮及花青素含量的影响不同果袋对果实中单宁含量的影响如图 2-2a 所示，套袋果实中单宁物质含量与对照相比显著下降。S1 和 S2 时，A 处理果实中单宁物质含量与 CK 无显著差异，随果袋透光率的减弱，果实中单宁含量下降，B、C 和 D 处理差异显著，S2 时果实中单宁含量增加。S3 时，果实中的单宁物质含量和 S2 时差异不大，

本文编号：2724766