基于露地菊盐胁迫转录组的CgbZIP基因克隆及表达分析

发布时间：2020-06-29 17:15

【摘要】：露地菊(Chrysanthemum ×grandiflora)具有花色丰富、植株低矮、花期集中、花多而密、易管理、抗性强等特点,是北方地区一种重要的观赏菊花。本研究以露地菊为研究对象,对盐胁迫处理的露地菊进行了转录组测序和数据分析,克隆了一个bZIP转录因子并进行了生物信息学分析、亚细胞定位,通过实时荧光定量分析该基因在根和叶中的表达,发现该基因响应盐、干旱和ABA的胁迫,同时利用转基因烟草对其抗旱和抗盐功能进行了初步验证。实验结果对进一步挖掘露地菊的抗逆转录因子奠定了基础。本文主要研究结果如下:1.使用Illumina Hiseq2500高通量测序平台对露地菊盐胁迫转录组进行测序,分别获得了 60370448和71415448条clean reads,通过序列拼接组装得到45591条Unigene,平均长度 724bp。有 37675 条 Unigene 在七大数据库(COG,GO,KEGG,KOG,Pfam,Swiss-Prot,NR)中得到注释。2.采用实时荧光定量PCR技术检测CgbZIP基因在三种不同非生物胁迫下在露地菊根和叶片中的表达量,结果显示CgbZIP基因对盐、干旱、ABA三种胁迫都有明显的响应,在根和叶中的表达量有差异。3.通过PCR克隆得到了完整开放阅读框为1020bp的CgbZIP基因,编码339个氨基酸,保守结构域分析显示其为 bZIP转录因子。该序列与黄花蒿(Artemisia annua L.)的同源性达到80.59%,蛋白相对分子量为37720.45,为亲水蛋白,蛋白肽链位于膜外,属于非跨膜蛋白。4.对构建好的PBI121-CgbZIP-GFP植物表达载体在洋葱表皮细胞上亚细胞定位,结果显示CgbZIP基因在细胞核上表达;将植物表达载体转入农杆菌内,通过叶盘法侵染烟草,用卡那霉素筛选和PCR鉴定得到9株转基因植株。5.通过对3个转基因烟草株系和野生型株系进行盐胁迫和干旱胁迫处理,观察表型并测其生理指标,结果显示转入CgbZIP基因有效增强了烟草对盐胁迫及干旱胁迫的抗性。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.11
【图文】：

分布情况,基因表达,测序,功能注释

图２－２邋ｑＰＣＲ验证深度测序的基因表达量逡逑Ｆｉｇ邋．２－２邋Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｕｎｉｇｅｎｅｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｑＰＣＲ邋ａｎｄ邋ｄｅｅｐ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑异表达基因功能注释和富集分析逡逑比对露地菊盐胁迫处理组和对照组样品间Ｕｎｉｇｅｎｅ的表达量，对其中因进行功能注释，统计结果如下：逡逑表２－５差异表达基因的功能注释在各数据库的分布情况逡逑Ｔａｂ．２－５邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａｂａｓｅ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｕｎｉｇｅｎｅｓ邋ｆｕｃｔｉｏｎ邋ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ逡逑释数据库名称Ｄａｔａｂａｓｅ邋ｎａｍｅ逦被注释数量Ａｎｎｏｔａｔｅｄ邋ｎｕｍｂｅｒ逡逑ＣＯＧ逦１５６６逡逑ＧＯ逦２４４１逡逑ＫＥＧＧ逦１５６９逡逑ＫＯＧ逦２３２７逡逑Ｐｆａｍ逦３５１５逡逑Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ逦３０１６逡逑ｎｒ逦４０４９逡逑Ａｎｎｏｔａｔｅｄ邋ｔｏｔａｌ邋ｎｕｍｂｅｒ逦４１４３逡逑

统计图,差异表达基因,传导通路,统计图

逦２邋ｍ逡逑Ａｎｎｏｔａｔｅｄ邋Ｇｅｒｖｅｓ逡逑图２－３差异表达基因和Ｕｎｉｇｅｎｅ在ＫＥＧＧ中分类统计结果逡逑Ｆｉｇ．２－３邋ＤＥＧｓ邋ａｎｄ邋Ｕｎｉｇｅｎｅｓ邋ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ＫＥＧＧ逡逑（４）露地菊植物激素信号传导途径相关基因的表达分析逡逑大量研究发现植物激素信号传导途径与植物的抗逆性密切相关，本研究的结果也与逡逑此相印证，在植物激素信号传导通路中发现的差异表达基因数量远高于其他通路，分析逡逑此通路中的差异表达基因，预测其功能并筛选潜在的抗盐性基因可作为日后分子克隆的逡逑目的基因，为露地菊耐盐基因挖掘提供参考依据。逡逑６４条差异表达基因在激素传导通路中参与了生长素（Ａｕｘｉｎ，ＩＡＡ）、细胞分裂素逡逑（Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）、赤霉素（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ，ＧＡ）、脱落酸（Ａｂｓｃｉｓｉｃ邋ａｃｉｄ，邋ＡＢＡ）、乙稀逡逑（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、油菜素内酯（Ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ，邋ＢＡ）、茉莉酸（Ｊａｓｍｏｎａｔｅ，ＪＡ）、水杨逡逑酸（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ邋ａｃｉｄ

【参考文献】