基于转录组和蛋白质组测序的中国甜柿自然脱涩基因筛选及DkMYB14功能解析

发布时间：2020-06-29 21:31

【摘要】：完全甜柿(简称“甜柿”)果实成熟后在树上自然脱涩,无需处理即可鲜食,且方便贮运、货架期长,是目前柿产业重点发展的品种类型,也是遗传改良的重要目标。与日本甜柿自然脱涩受隐性基因控制有别,中国甜柿自然脱涩性状受显性单基因位点控制,因而在完全甜柿的遗传改良中具有重要的应用前景,但其关键基因及其调控网络尚不完全清楚。本研究基于RNA-seq和iTRAQ技术对中国甜柿‘鄂柿1号’花后10周(此期日本甜柿自然脱涩,而中国甜柿和非完全甜柿尚未脱涩)、20周(此期中国甜柿自然脱涩而非完全甜柿尚未脱涩)和花后10周温水(40℃·12 h)脱涩处理及对照(室温放置,25℃·12 h)果实进行差异基因和差异蛋白分析,筛选到一批与柿果脱涩相关的候选基因。在此基础上,对其中差异表达的MYB转录因子进一步筛选获得了一个参与中国甜柿自然脱涩的关键基因DkMYB14,并解析了其在自然脱涩中的作用机制。主要研究结果如下:1.转录组组装及差异表达基因和差异表达蛋白鉴定。转录组组装获得非冗余Unigene 135,999条,总长166,861,433 nt,平均长度为1,227 nt,N50达到了2,071 bp。其中3,818个Unigenes在自然脱涩过程中差异表达,15,597个Unigenes在温水脱涩处理前后差异表达。通过iTRAQ技术共鉴定出4,954个蛋白,其中3,041个蛋白被2段以上不同肽段覆盖(61.37%),筛选获得523个差异表达蛋白。2.差异表达基因和差异表达蛋白功能分析。自然脱涩过程中,上调基因主要与糖代谢、果实色泽、信号转导以及乙烯响应有关;温水脱涩处理过程中,上调基因主要与糖酵解、丙酮酸代谢以及热激应答有关;两个脱涩过程中的下调表达基因均涉及广泛的生物学过程,如催化活性、信号转导及次生物质代谢等。在自然脱涩和温水脱涩两个过程中分别有228和633个Unigenes共同上调和下调表达;其中共同上调表达的228个基因主要与糖代谢有关;共同下调表达的633个基因主要与类黄酮、花青素代谢及激素调节有关。乙醛代谢相关基因在温水脱涩处理和自然脱涩过程中显著上调表达,但在温水处理中更剧烈;同时,与柿单宁生物合成相关的基因/蛋白在两个脱涩过程中均显著下调表达。在自然脱涩过程中,分别有95和65个Unigenes和其对应的蛋白共同上调和下调表达,其中65个共同下调的基因/蛋白主要与柿单宁生物合成相关,而共同上调的95个基因/蛋白则主要与糖代谢过程有关。在温水处理脱涩过程中分别有54和51个基因与其对应的蛋白共同上调和下调表达,其中51个共同下调的基因/蛋白质主要与莽草酸代谢过程有关,而共同上调的54个基因/蛋白则主要与热激响应有关。在自然脱涩和温水脱涩过程中分别鉴定出43和136个特异上调表达的转录因子,20和122个特异下调表达的转录因子,其中10个转录因子,包括4个ERF、3个NAC、2个WRKY和1个Zinc finger共同上调表达,16个转录因子包括2个bHLH、1个bZIP、3个ERF、2个WRKY和8个Zinc finger共同下调表达。此外,ERF、MYB、NAC、WRKY等转录因子在自然脱涩过程中大量表达。3.DkMYB14功能鉴定及作用机制解析。基于转录组和蛋白质组测序分析结果,进一步对在自然脱涩中差异表达的7个MYB转录因子进行了功能鉴定。通过RACE技术获得其基因全长(依次命名为DkMYB14-20)。多重比较分析表明,仅DkMYB16为R3型MYB转录因子,其余均属于R2R3型MYB转录因子。系统进化分析将7个MYB转录因子归类到不同的分支,其中DkMYB14与其他苯丙烷生物合成抑制基因聚为一个分支,属MYB亚家族4亚组,在C2区域中存在一个EAR类似转录抑制基序LxLxI。DkMYB14定位于细胞核,其在7个MYB转录因子中表达水平最高,且在中国甜柿自然脱涩关键时期(花后15-20周)特异上调表达,与中国甜柿可溶性及不溶性单宁累积模式相关,初步确定DkMYB14为候选的关键基因。在柿叶片中瞬时超表达DkMYB14导致可溶性单宁含量显著降低,同时不溶性单宁含量增加;相反,干涉表达DkMYB14后可溶性单宁含量显著增加。进一步在拟南芥中稳定转化DkMYB14同样使可溶性单宁显著降低,不溶性单宁增加。qRT-PCR表达分析表明,DkMYB14抑制单宁生物合成途径基因的表达,同时,促进与可溶性单宁凝固相关基因ADH1和PDC2的表达,其基因表达水平与可溶性和不溶性单宁含量的变化一致。结合酵母单杂交和双荧光素酶分析实验,证明了DkMYB14可以直接抑制单宁生物合成特异基因DkANR和DkF3'5'H的表达,同时能激活DkADH1和DkPDC2的表达,从而导致可溶性单宁的降低。启动子分段实验表明,5'-TTTAGTTA-3'基序为DkMYB14在DkPDC2启动子上的核心结合元件。最后,在柿果圆片上瞬时超表达DkMYB14,获得了与柿叶片瞬时超表达及拟南芥稳定转化相同的结果,进一步证明了DkMYB14是调控中国甜柿自然脱涩的关键基因。综上所述,本研究通过全基因组筛选获得一批在柿果脱涩过程中差异表达的转录因子基因,其中DkMYB14为首次发现的调控中国甜柿自然脱涩的关键转录因子基因,该基因的发现对完全甜柿的分子育种和遗传改良具有重要意义。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S665.2
【图文】：

脱涩,柿品种,类型

图 1-1 不同脱涩类型柿品种分类（根据 Akagi et al 2011，有修改）Classification of different astringent types of persimmon cultivars modified fret al (2011)

单宁,日本甜柿

图 1-2 柿单宁结构（Matsuo and Ito 1978）Fig. 1-2 The chemical structure of persimmon-tannin (Matsuo and Ito 1978)Yonemori et al（1983）以不同发育时期的日本甜柿和非完全甜柿果实为试材，分析了两种柿果单宁成分组成及含量的动态变化。发现儿茶素和没食子酸为柿单宁

【参考文献】