多组学分析中国野生毛葡萄芪类物质代谢调控机制

发布时间：2020-06-29 20:54

【摘要】：葡萄是世界上重要的栽培果树之一,欧洲葡萄品种因其优质与高产的特性被广泛用于酿酒、鲜食及制汁、制干。欧洲葡萄突出缺点是抗病抗逆性差,尤其易感白粉病。研究表明,葡萄中的芪类物质白藜芦醇既有植保素的抑菌作用,又有助于人体健康。中国是葡萄三大起源中心之一,蕴藏着丰富的抗性资源与抗性基因。中国野生毛葡萄‘丹凤-2’不仅抗病性强而且白藜芦醇含量高,但是其白藜芦醇代谢调控途径研究并不清楚。本研究以毛葡萄‘丹凤-2’为材料,以欧洲葡萄品种‘赤霞珠’为对照,通过转录组、蛋白质组和代谢组多组学联用,从转录水平和蛋白水平分析‘丹凤-2’白藜芦醇含量高的遗传机制,挖掘调控白藜芦醇合成的相关基因,为进一步解析白藜芦醇代谢调控机制奠定基础。取得主要结果如下:1、转录组测序表明其中丹凤-2表达基因数目为19,008个,赤霞珠表达基因数目为19,373个。‘丹凤-2’存在54条芪合成酶基因,而‘赤霞珠’中为48条。其中,‘丹凤-2’存在6条特异芪合成酶转录本。通过对‘丹凤-2’和‘赤霞珠’的果实在四个发育时期的转录组测序分析,获得两者在各个发育时期的差异表达基因,使用GO富集,KEGG富集以及MapMan分析差异表达基因参与的代谢通路及生物学过程,发现在转色期和成熟期差异表达代谢途径主要为苯丙氨酸代谢途径,光合途径,细胞壁组分代谢以及脂肪酸代谢途径;并且在苯丙氨酸代谢途径中,芪合成酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因在‘丹凤-2’中高表达,而在‘赤霞珠’中,查尔酮合成酶基因高表达。除芪类代谢相关基因外,还发现生物胁迫基因、抗病基因、转录因子基因、光合基因、脂肪代谢基因、细胞壁组分有关基因和木质素基因等差异表达基因,在‘丹凤-2’和‘赤霞珠’中表达增强基因数目分别为:72个/116个,46个/70个,179个/150个,50个/1个,66个/62个,26个/91个以及14个/24个。‘丹凤-2’在转录因子基因增强表达基因数目明显多于‘赤霞珠’,预示‘丹凤-2’在转录调控相关代谢途径强于‘赤霞珠’。2、蛋白质组测序得到3,751个蛋白质,包括细胞过程(1,180个),发育过程(198个),生长(4个),免疫系统过程(26个),细胞和组织互作(120个),定位(181个),代谢过程(269个),调节(355个),再生(1个),胁迫应答(544个)和其它(227个)。通过蛋白质组分析‘丹凤-2’和‘赤霞珠’果实在四个发育时期差异表达的蛋白,发现芪合成酶和查尔酮合成酶在次生代谢途径中竞争底物香豆酰辅酶A,在‘丹凤-2’果实发育的转色期和成熟期,芪合成酶和芪类物质合成生物学过程得到增强。3、通过代谢组分析‘丹凤-2’和‘赤霞珠’在果实发育四个时期差异积累的代谢物质,共鉴定到203种物质,其中,‘丹凤-2’中芪合成酶和查尔酮合成酶的上游物质包括苯丙氨酸、羟基肉桂酸积累量高于‘赤霞珠’。采用高效液相色谱方法检测‘丹凤-2’和‘赤霞珠’果实在硬果期、转色前期、转色期和成熟期中白藜芦醇及云杉新苷的含量,发现‘丹凤-2’在各发育时期芪类物质含量均高于‘赤霞珠’。并且在‘丹凤-2’果实成熟期白藜芦醇及云杉新苷含量最高。同时,对‘丹凤-2’和‘赤霞珠’果实在四个发育时期黄酮类物质和花青苷物质含量进行测定,发现‘赤霞珠’果实中黄酮类物质和花青苷类物质整体含量显著高于‘丹凤-2’。4、以白藜芦醇为底物,在氧甲基转移酶,漆酶和白藜芦醇糖基转移酶催化下分别生成紫檀芪,葡萄素和云杉新苷。用全基因组分析苯丙氨酸代谢途中与白藜芦醇衍生物合成相关的基因家族,鉴定到58条氧甲基转移酶基因,77条漆酶基因和49条白藜芦醇糖基转移酶基因。通过聚类、基因结构与基因保守模体的分析,发现葡萄白藜芦醇衍生物代谢基因家族成员存在功能冗余和功能分化,并且具有时空表达差异,其中三类基因在‘丹凤-2’表达水平均高于‘赤霞珠’。5、芪合成酶基因表达受6类转录因子调控。通过共表达分析筛选调控芪合成酶基因的转录因子,鉴定到52个候选正调控转录因子,包括6个bHLH,2个bZIP,19个ERF,16个MYB,8个WRKY和1个NAC基因;同时鉴定到3个候选负调控转录因子,分别为1个bHLH,1个MYB和1个bZIP基因。其中,‘丹凤-2’中有5个bHLH,1个bZIP,16个ERF,12个MYB,8个WRKY和1个NAC基因共计43个转录因子基因上调表达,而‘赤霞珠’中只有9个转录因子基因上调表达。进一步酵母单杂交实验验证,结果表明12个得分最高的候选转录因子中11个转录因子与芪合成酶基因启动子结合。此外,我们初步研究了一个与拟南芥脱落酸合成调节转录因子ATAF1同源的转录因子VqNAC1的功能。结果表明葡萄叶片中瞬时表达VqNAC1促进芪类物质积累,并且增加了脱落酸合成相关基因以及PR1基因的表达。6、在转录组数据中发现的1,112条长链非编码RNA进行了共表达分析,筛选到4条参与调控芪合成酶基因的候选长链非编码RNA;通过实验研究发现其中的2条长链非编码RNA可以上调芪合成酶基因表达。综上所述,经过多组学分析两个材料在各个发育时期的差异表达,使用GO富集,KEGG富集以及MapMan分析差异表达基因参与的代谢通路及生物学过程,揭示了在果实发育过程中芪合成酶基因的表达与芪类物质产物累积的内在因素与调控网络关系;发现了芪合成酶基因的表达受到多种转录因子的调控作用,特别是在‘丹凤-2’中鉴定到6个特异芪合成酶转录本以及2个参与调芪合成酶基因表达的长链非编码RNA的新发现,这些基因数据信息为今后系统研究与利用中国野生毛葡萄‘丹凤-2’的芪合成酶基因及其调控表达功能,与欧洲葡萄品种杂交,提高抗病性与芪类物质含量的育种提供了科学依据。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S663.1
【图文】：

示意图,白藜芦醇,衍生物,示意图

第一章文献综述冗余还是参与不同的生物学过程仍待研究 (Parage et al. 2012; Richter 芪合成酶和查尔酮合成酶在氨基酸序列上有 75%-90%的相似性，已有研成酶从查尔酮合成酶进化而来 (Tropf et al. 1994)。特别是 1997 年美国《科道，葡萄浆果中含有对人体抗癌抗衰老的功能成分白藜芦醇。在人体代谢，白藜芦醇被人体吸收后转化成云杉新苷由血浆蛋白、脂蛋白携运至各组人体保健有重要作用。在植物体内，白藜芦醇是一种天然植保素，对植物有抑制作用。此外，白藜芦醇存在三类衍生物，紫檀芪，葡萄素和云杉新究报道，紫檀芪和葡萄素可以抑制真菌孢子萌发。而白藜芦醇，紫檀芪，杉新苷统称为芪类物质，后三者为白藜芦醇衍生物。

转录组,发育时期,果实,葡萄

20图 3-1 两个葡萄材料果实四个发育时期转录组测序分析（A）两个材料果实四个发育时期的果实性状。中上半部分为丹凤-2 果实四个发育阶段性状和形态，分别为硬果期（花后 25 天）、转色前期（花后 40 天）、转色期（花后 50 天）和成熟期（花后 80 天）；下半部分为赤霞珠果实四个发育时期性状和形态，分别为硬果期（花后 30 天）、转色前期（花后 45 天）、转色期（花后 60 天）和成熟期（花后 110 天）。（B）两个材料果实四个发育时期中表达基因数目以及表达转录因子数目。其中丹凤-2 表达基因数目为 19,008 个，赤霞珠表达基因数目为 19,373 个。（总基因数目）葡萄中总基因数目为 29,927 个。（C）两个材料果

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