日本结缕草滞绿基因（ZjSGR）的功能研究

发布时间：2020-06-30 05:51

【摘要】：较短的绿期是限制日本结缕草(Zoyisa japonica)进一步推广应用的关键,同时日本结缕草的基因资源尚未得到有效开发利用,其叶绿素降解途径及调控机理尚不明确。滞绿基因是调控叶绿素降解的一类重要基因,在植物衰老和响应环境胁迫中也发挥着多方面的调节作用。本研究的目的旨在从日本结缕草中分离得到滞绿基因,鉴定其功能,并分析其调控机理,进而为基因工程育种提供依据。本研究主要围绕基因和启动子的克隆、生物信息学分析、基因表达模式、亚细胞定位、转基因过表达、滞绿突变体恢复、转基因株系的生理生化分析、启动子活性分析、叶绿体超微结构观察和RNA-seq测序分析等方面开展了研究,得到如下研究结果:1.ZjSGR及其启动子的克隆。利用染色体步移的方法克隆得到ZjSGR的gDNA序列(KP148820)和cDNA序列(KP148819),同时获得ZjSGR基因编码区上游1029bp的启动子序列。生物信息学分析表明ZjSGR属于滞绿基因家族,启动子包含响应黑暗和多种激素的顺式作用元件。2.ZjSGR的表达模式分析。利用实时荧光定量技术(qRT-PCR)分析了 ZjSGR的表达特征,结果表明:ZjSGR在日本结缕草的根、茎、叶中均可表达,但是在叶片中的表达量最高;ZjSGR可响应衰老信号,并且可受黑暗、ABA和MeJA的诱导。3.ZjSGR的亚细胞定位情况。利用本生烟草瞬时表达的方法分析了Zj SGR的亚细胞定位情况,结果显示ZjSGR定位在叶绿体,并且ZjSGR的瞬时表达可引起本生烟草叶片黄化。4.转基因拟南芥的获得及表型分析。利用花序侵染法,成功获得转基因拟南芥株系。ZjSGR的过表达可引起野生型拟南芥叶片提早黄化,叶绿素含量下降,光合速率降低,光合系统相关基因表达下降。5.滞绿突变体nye1-1的恢复。ZjSGR在拟南芥滞绿突变体nye1-1中的表达可以恢复其滞绿表型,说明ZjSGR是AtNYE1的同源基因。6.启动子活性分析。利用转基因拟南芥分析了ZjSGR的启动子活性,结果表明:ZjSGR的启动子驱动GUS可在拟南芥的叶片中高效表达,且在叶脉和毛状体中有明显分布;另外,黑暗、ABA和MeJA处理可诱导GUS表达明显增强。7.转基因拟南芥的叶绿体超微结构观察。利用透射电镜观察了ZjSGR在瞬时表达的本生烟草和稳定表达的拟南芥的叶绿体超微结构,结果表明ZjSGR的过表达可影响叶绿体正常的发育,或可影响叶绿体结构的稳定性。8.转基因拟南芥的RNA-seq分析。RNA-seq分析结果表明ZjSGR加速了转基因拟南芥的衰老,这与ZjSGR对激素合成、信号传导和转录因子的调节有关;ZjSGR除了直接参与到叶绿素降解途径的反应之外,还在植物生长发育的其他方面发挥作用。本研究结果表明ZjSGR是调控叶绿素降解的一个重要基因,并可在调节植物衰老和生长发育等其他方面发挥作用。本研究为更好地理解SGRs的功能、叶绿素降解和衰老调控机理提供了依据。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S688.4;Q943.2
【图文】：

叶绿素捕获光能并将其传递到光合反应的反应中心，因此叶绿素及其衍生物在合系统中发挥着关键作用。绿色植物的叶绿素可分为叶绿素ａ和叶绿素ｂ两种，这两叶绿素的合成途径目前己经研宄明确（Ｔａｎａｋａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７）。简要来说，叶绿素ａ（Ｃｈｉ邋ａ）逡逑由５－氨基乙酰丙酸经过一系列的复杂反应合成；在Ｃｈｉ邋ａ合成的最后一步，部分７－羟基叶绿素ａ邋（７－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ邋ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ邋ａ）在脱植基叶绿素加氧酶（ＣＡＯ）的作下转化为叶绿素ｂ邋（Ｃｈｉ邋ｂ）。Ｃｈｉ邋ｂ在叶绿素ｂ还原酶（ＣＢＲ）和７－羟甲基叶绿素ａ还酶（ＨＣＡＲ）的作用下转化为Ｃｈｌａ（Ｍｅｇｕｒｏｅｔａｌ．，２０１１）。研宄表明拟南芥中含有ＮＹＣｌ和ＮＯＬ这两种ＣＢＲ（Ｈｏｒｉｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００９）。Ｃｈｉ邋ａ和Ｃｈｉ邋ｂ相互转化的这…过程称为叶绿素环，参与叶绿素合成和叶绿素循环的酶己全部分离鉴定，叶绿素循环途径己经明确因为Ｃｈｉ邋ｂ须经过叶绿素循环转化为Ｃｈｉ邋ａ之后才能进行下一步的代谢途径，所以叶素循环对于叶绿素降解途径来说必不可少（Ｈ６ｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ，邋２００６）。逡逑１．５．４叶绿素降解途径逡逑叶绿素降解是氮素循环的关键环节，在保护细胞免受损伤方面也有重要的作用如果对叶绿素降解的调节发生紊乱，那么会发生严重的光敏损伤，并引发细胞凋（Ｈ６ｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１）。根据反应发生部位之小Ｎ，叶绿素降解途径大致分为两

图１－３叶绿素降解途径（Ｃｈｅｎ邋ｅｔａｌ．，邋２０１６）逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑．５滞绿基因的其它功能逡逑研宄表明ＳＧＲ除直接调控叶绿素降解之外，在植物衰老和其他生理代谢方面也着重要的作用。Ｚｈｏｕ邋ｅｔａｌ．邋（２０１１）的研究表明ＭＳＧ７？调节叶片衰老并参与根瘤进程（Ｚｈｏｕ邋ｅｔａｌ．，邋２０１１）。的表达量在大多数器官中维持在较低的水平，但片衰老阶段明显升高。ＭＳＧ／？在根瘤中的表达量经Ｎ０３的诱导升高了８倍。逡逑调节乙烯受体基因的表达从而调节乙烯信号传导途径，并且与ＰＳＹ１基因互作在色素形成及果实成熟中起到关键的作用（Ｌｕｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１３）。价可调节一的基因来调控芸薯的生长发育和对外界环境的适应能力，并且还可以影响油脂的（Ｑｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１６）。因此，有必要通过进一步的研宄来探索双Ｍ在植物生长发育理代谢和对外界环境的适应等其他方面的功能（Ｃｈｅｎ邋ｅｔａｌ．，邋２０１６）。逡逑７本研究的目的及内容逡逑．１研究目的逡逑

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本文编号：2734944