番茄MADS-box家族转录因子SOC-like4（SlSL4）调控果实成熟的功能研究

发布时间：2020-06-30 14:50

【摘要】：果实成熟是一个复杂的生理生化过程总和,涉及果实颜色变化、细胞壁代谢及果实软化、风味物质和营养成分变化和糖代谢等,这些变化不仅利于果实种子扩散,而且为人类和动物的饮食提供了必要的营养。因此,果实成熟的研究,特别是肉质果实的成熟调控成为近年来科学家们研究的热点。在前期工作中,我们利用野生型番茄AC~(++)、番茄成熟突变体(Cnr,rin,nor)的不同发育时期果实RNA为实验材料,进行基因芯片分析,比较了番茄果实不同成熟突变体(Cnr,rin,nor)处于不同发育时期的番茄果实基因芯片数据,并采用人工神经网络ANN的方法成功建立番茄果实成熟的信号调控网络模型。通过该神经网络模型,发现了大量与番茄果实成熟调控密切相关的特异基因,尤其是在果实成熟过程中表达的低丰度转录因子。其中发现了一个基因——SOC-Lile 4(SlSL4),该基因与番茄果实的成熟密切相关,并在非乙烯调控果实成熟突变体中起到核心调控作用。为了进一步分析该基因在番茄果实中可能存在的功能,本研究取得了以下主要结果:1.我们分离并克隆得到了番茄SlSL4基因(NCBI登录号:XM_004234224)。SlSL4基因CDS区全长为498bp,编码165个氨基酸。SlSL4定位于细胞核,具有多个核酸和蛋白结合位点。SlSL4属于MADS-box基因家族,具有典型的MADS结构域。2.通过荧光定量PCR技术对SlSL4基因的表达模式分析发现:(1)SlSL4基因在番茄各组织中的表达水平有差异:该基因在番茄花、果实、萼片和根中均有表达,且在花和果实中大量表达,但是在叶片中表达量较少;(2)SlSL4基因在野生番茄AC~(++)和果实成熟突变体rin、nor、Nr的果实成熟不同时期中的表达水平有差异,该基因在突变体nor、Nr果实中的表达量明显高于野生型果实;SlSL4基因在野生型成熟不同时期果实中的表达量呈现先上升后下降的趋势,并在破色期到达最大值;(3)通过SlSL4在5种激素(Eth,ABA,GA,SA,JA)处理后的番茄叶片中的表达模式分析发现:SlSL4基因在乙烯处理的叶片中的表达水平高于野生型,该基因可能参与乙烯调控途径。3.为了研究SlSL4基因在番茄成熟调控中的具体功能,我们分别构建了SlSL4基因的超表达载体与RNAi沉默载体,通过农杆菌介导转化野生番茄AC~(++),培育出并筛选得到SlSL4基因超表达和RNAi沉默的转基因番茄株系。通过对SlSL4超表达转基因番茄果实的研究发现:相同环境下SlSL4超表达转基因番茄果实比野生番茄果实成熟时间推迟;SlSL4基因RNAi沉默的转基因番茄植株研究发现该植株开花极易脱落且不易结果。4.在mRNA水平对SlSL4基因的功能进行分析,结果显示:转基因番茄果实中乙烯生物合成相关基因(ACO1,ACO3,ACS2)和乙烯合成上游基因RIN的表达水平在果实成熟的不同时期明显下调,乙烯响应基因(E4,E8,ERF1)表达水平同样下调;转基因番茄果实中类胡萝卜素合成关键酶基因PSY1的表达相较于野生型果实有明显差异;这些结果说明SlSL4基因可能参与乙烯调控途径并且影响番茄果实的成熟。5.利用酵母双杂交技术我们对SlSL4蛋白与番茄中其他参与果实成熟调控的MADS-box蛋白间进行了相互作用分析,结果发现:SlSL4蛋白可与SlMADS-RIN、SlMADS1和SlTAGL1蛋白之间分别发生相互作用,说明SlSL4蛋白可能与SlMADS-RIN、SlMADS1和SlTAGL1蛋白同样具有调节果实成熟的功能,在番茄果实成熟调控网络中发挥作用。同时,酵母双杂交结果显示SlSL4蛋白与番茄离区发育相关蛋白SlMADS-MC和JOINTLESS不发生相互作用,表明SlSL4蛋白可能不是通过与SlMADS-MC和JOINTLESS蛋白互作来控制花的脱落和结果的。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S641.2
【图文】：

模型图,乙烯合成,转导,番茄

图 1.1 番茄乙烯合成和信号转导模型(Liu, Pirrello et al. 2015)e 1.1 Simplified scheme showing ethylene synthesis and response in tPirrello et al. 2015)跃变型果实中已经提出了两个乙烯生物合成系统t al. 1972)。系统 1 负责跃变型果实跃变期之前和非跃变型组织所产生的基础水平的乙烯。系统 1 是自抑制乙烯产生程中起作用，系统 2 在呼吸跃变成熟期运行，并能自生催系统 1 乙烯的产生依赖于 ACS1A 和 ACS6 的表达，都受乙激活是由乙烯的正调控使 ACS2 和 ACS4 上调反应形成的l. 1998; Barry, Llop-Tous et al. 2000)。在系统 1 里 ACO1 和中低表达，但是它们的转录水平随着乙烯产量的增加而升统 2 的过渡。此外，ACO4 在果实成熟时期持续稳定的表达l. 1998)。乙烯生物合成基因的表达受发育调控因子调控，S2 和 ACO1 启动子来调节表达的 RIN 和 LeHB-1 (Lin, Hoano et al. 2013)，因此，系统 2 乙烯生产可能不是促成跃变

序列,结构域,基因,外显子

图1.4 MADS-box蛋白的分类及结构(Alvarezbuylla and Al 2000; Becker, Winter et al. 2000; BoRaes et al. 2003)Figure 1.4 Classification and structure of MADS-box protein(Alvarezbuylla and Al 2000;Becker, Winter et al. 2000; Bodt, Raes et al. 2003)目前，研究较多的 MADS-box 基因是类型 2 中的 MIKC 型基因，而类型 1基因相对研究较少。植物中属于类型 2 的 MADS-box 基因具有 M、I、K、C 四主要结构域，而根据 I 结构域的蛋白序列和结构的差异，将 MIKC 型分为：MIK型和MIKC*型。MIKC 型MADS-box 基因通常含有7-8个外显子和6-7个内含子一般情况下，M 结构域是由 1 个位于 N 端的外显子编码，K 结构域由 3-5 个位N 端的外显子编码，C 末端由最后的 2-3 个外显子编码。N 末端的 M 结构域是中最保守的，是由 50-60 个氨基酸残基组成的。M 结构域具有与目标基因特异合作用的序列 CC(A/T)6GG(CArG-box)(Shore and Sharrocks 1995)。例如：番茄SlMADS-RIN 基因可结合 CArG-box 结构域，然后调控自身表达和其下游基因：ACACS2、PG、TBG4 等(Fujisawa, Nakano et al. 2011)。I 结构域大约由 30 多个亲水基酸残基组成，位于 M 结构域与 K 结构域之间，主要和 M 结构域一起决定转

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