榨菜和紫甘蓝嫁接嵌合体后代表观遗传变异的发生及其维持机理

发布时间：2020-07-08 01:49

【摘要】：本研究以榨菜(Brassica juncea(L.)Czern.et Coss.var.tumitda Tsen et Lee)与紫甘蓝(B.oleracea L.var.capitata L.)的茎尖嫁接嵌合体为材料,通过对组织培养条件下嵌合体茎段基部不定芽的诱导获得嵌合体的无性繁殖后代,利用该无性后代开展了嫁接诱导性状变异及其维持机制的分子机理研究。通过形态学观察以及分子标记鉴定,明确无性后代的细胞谱系;通过全基因组甲基化图谱分析,明确亲本和后代的DNA甲基化模式差异,分析DNA甲基化变异位点与变异性状的关系;通过small RNA高通量测序,解析嫁接引起的小RNA种类和表达量的变化,并通过对小干扰RNA(siRNA)和DNA甲基化的关联分析,明确全基因组甲基化差异位点与siRNA的关系,阐明siRNA调控甲基化变异的机理。通过对siRNA表达模式及甲基化酶转录水平的分析,探究嫁接诱导表观遗传变异的维持机制。主要结果如下:(1)以榨菜和紫甘蓝种间周缘嵌合体TCC[茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM)三个细胞层,由外而内为LⅠ-LⅡ-LⅢ,'T'代表LI起源于榨菜tubermustard,'C'代表LⅡ和LⅢ起源于紫甘蓝red cabbage]的茎段为外植体进行不定芽的诱导,并利用形态学特征和分子标记鉴定不定芽的细胞谱系。在添加不同浓度6-BA的MS诱导培养基中,从茎段基部直接再生的不定芽诱导频率随6-BA浓度的升高而增大。特异引物PCR以及简单重复序列标记显示不定芽起源于紫甘蓝谱系,即嵌合体SAM的LⅡ和/或LⅢ细胞层,命名为r-CCC(r=regenerated)。对r-CCC通过腋芽诱导进行无性繁殖,构建无性后代r-CCCn(n = generation)。再生的不定芽及其无性后代叶片光滑无表皮毛,叶脉处和茎为紫红色,在形态学上与紫甘蓝亲本相似,然而与对照材料相比表现出叶片蜡质含量明显减少的表型变异。扩增片段长度多态性分析结果显示,r-CCC中未出现榨菜亲本的特异条带,但与r-s-CCC(s=self-grafted)相比存在0.76%的差异条带,且差异位点主要分布于非编码的基因间区。(2)对r-CCC4和r-s-CCC4全基因组甲基化图谱分析发现,r-CCC4中CHH类型胞嘧啶的甲基化水平和比例均高于r-s-CCC4,并且在转座元件等重复序列上的CHH类型甲基化水平升高最为明显。对甲基化差异位点相关基因(DMG)的KEGG通路富集分析发现,13个DMGs参与蜡质合成Cutin,suberine and wax biosynthesis通路。通过重亚硫酸氢盐测序技术对基因LOC106335792,LOC106298662,LOC106311786和LOC106333935上差异位点的甲基化模式的验证结果与全基因组重亚硫酸氢盐甲基化测序数据一致。实时荧光定量PCR分析结果表明,差异基因在r-CCC4和r-s-CCC4中的转录水平不同,其中基因LOC106335792和LOC106311786在r-CCC4中的表达水平显著降低,可能为蜡质含量变异的候选基因。(3)对r-CCCn和r-s-CCCn中蜡质合成相关DMGs的甲基化模式分析发现,嫁接引起的甲基化模式变异能够在无性繁殖过程中稳定维持。对相关甲基化转移酶的转录水平分析结果表明,MET1在r-CCC2和r-CCC4的表达水平显著升高,推测其负责维持CG类型的DNA甲基化变异;而CMT3在r-CCCn中的表达水平均低于r-s-CCCn,可能参与维持CHG类型的甲基化变异。此外,对嵌合体花粉中的甲基化模式分析发现,DNA甲基化变异可以通过减数分裂进行传递。(4)以r-s-TTT,r-s-CCC和r-CCCn为材料,通过small RNA高通量测序分析异源嫁接对小RNA种类及表达量的影响。研究结果揭示,嵌合体无性后代中绝大多数siRNA的表达水平明显升高,并且与基因组重复序列相关小RNA的比例在无性后代中呈现逐渐升高的趋势。在多代无性材料中鉴定到1135种嫁接诱导的特异siRNA,包括159种榨菜亲本中的特异转录产物。此外,对miRNA的表达水平分析发现,22种novel miRNA的表达水平在r-s-CCC和r-CCCn中表现出显著差异,差异表达的novelmiRNA靶基因主要编码功能蛋白,包括锌指蛋白、ABC运载体以及与抗病性有关的TAO1蛋白等。此外,一种与光周期开花途径相关的已知miRNAbol-miR157a在r-CCCn中被显著抑制表达。(5)通过DNA甲基化和small RNA关联分析,发现65%的特异siRNA与重复元件相关,而且重复元件相关siRNA靶定区域的CHH类型胞嘧啶在嵌合体无性后代中表现为高甲基化修饰。异源嫁接诱导的转座元件相关siRNA能够在细胞再生和无性繁殖多代中稳定存在,推测这些siRNA可能参与维持基因组的稳定性,从而实现嫁接变异在后代的维持。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S637.3;S635
【图文】：

甲基化,从头甲基化,植物,靶向

博士学位论文并招募从头甲基化酶ＤＭＨ２到靶向位点上建立ＤＮＡ从头甲基化，类型甲基化（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋｉ邋ｄａ／．，邋２００８；邋Ｌａｗ邋ａｎｄ邋Ｊａｃｏｂｓｅｎ，邋２０１０）。此外，２１－２５邋ｎｔ邋的邋ｓｉＲＮＡ邋均有可能参与邋ＲｄＤＭ邋机制（Ｍｅｉｓｔｅｒ邋ａｎｄ邋Ｔｕｓｃｈｌ，ａｔｔｕ邋ｅ／邋ａ／．，邋２０１３邋）邋０逡逑

试管苗,离体,嵌合体

多种植物嵌合体材料（Ｈｅｉｃｈｅｌ邋ｅ／ｆｌ／．，１９７８；邋Ｂｕｒｇｅ邋ｅ／ａ／．，邋２００２；邋Ｙｏｓｈｉｄａ邋Ｗａ／．，邋２００４），逡逑并由此推进了对嫁接过程组织器官的发育、细胞间信息交流以及嫁接变异等问题逡逑的研究。Ｈｉｒａｔａ和Ｎｏｇｕｃｈｉ等在Ｗｉｎｋｌｅｒ的方法上改进的茎尖离体靠接法逡逑（ａｐｐｒｏａｃｈ－ｇｒａｆｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｖｖＹｒｏ，ＡＧＳＣ邋ｍｅｔｈｏｄ）使嫁接嵌合体的获得更为逡逑高效，并在芸薹属蔬菜上获得很大的成功（Ｈｉｒａｔａｅ／ｏ／．，邋１９９０；Ｎｏｇｕｃｈｉ邋ｅ／ａ／．，１９９２；逡逑Ｎｏｇｕｃｈｉ以ａ／．，邋１９９４；邋Ｈｉｒａｔａ邋ｅｆ邋ａ／．，２００１邋）６该方法利用试管苗嫁接法，也称微嫁接逡逑技术，通过植物组织培养与离体嫁接技术的结合，将两个嫁接材料的幼苗茎尖部逡逑位（各携带一片子叶）紧密靠在一起，置于培养基上培养，待两者之间的嫁接伤逡逑口愈合后，将嫁接体愈合的顶端、紧邻顶端下的横切部分以及愈合的下胚轴三个逡逑部分切离，并转移到含有生长素和细胞分裂素的不定芽诱导培养基上，嵌合体的逡逑芽便能形成，进而由不定芽发育为完整的植株（Ｎｏｇｕｃｈｉ邋ｅ／ａ／．，１９９２）。通过该方逡逑法获得嫁接嵌合体的效率更高，但也较易出现扇形嵌合体、混合型嵌合体等不稳逡逑定类型。逡逑

基部,茎段,浓度,频率

浓度的提高而增加，在含有０．２邋ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ的ＭＳ培养基中，基部切面上产生少逡逑数独立的、分散的不定芽。当６－ＢＡ浓度升高至０．８ｍｇ／Ｌ时，基部切面上形成簇逡逑状丛生的不定芽（图２．１）。为便于分离和观察，后续实验中均选用含０．２ｍｇ／Ｌ６－逡逑ＢＡ的ＭＳ培养基作为不定芽诱导培养基。逡逑ｒｘｘｉ逡逑图２．１６－ＢＡ的浓度对茎段基部不定芽诱导频率的影响。（ａ）和（ｄ）ＭＳ＋０．２ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ；邋（ｂ）逡逑和（ｅ）邋ＭＳ邋＋邋０．４ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ；邋（ｃ）和（ｆ）邋ＭＳ邋＋邋０．８ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｅｍ邋ｂａｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ邋ｓｈｏｏｔｓ邋ｏｎ邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ逡逑ｏｆ邋６－ＢＡ．邋（ａ）邋ａｎｄ邋（ｄ）邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋０．２邋ｍｇ／Ｌ邋６－ＢＡ．邋（ｂ）邋ａｎｄ邋（ｅ）邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋０．４邋ｍｇ／Ｌ邋６－逡逑ＢＡ．邋（ｃ）邋ａｎｄ邋（ｆ）邋ＭＳ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｗｉｔｈ邋０．８邋ｍｇ／Ｌ邋６－ＢＡ．逡逑３０逡逑

【参考文献】