柑橘黄龙病菌分子检测技术的建立应用及梨火疫病菌T6SS核心基因clpV的功能初析

发布时间：2020-07-08 02:43

【摘要】：相柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing),属于系统侵染的细菌病害,病原是韧皮部杆菌亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus),属于难培养细菌。该病病症复杂,易与缺素、病毒病害等混淆。柑橘黄龙病在中国发生很严重,严重为害柑橘产业。目前对于黄龙病尚无有效治理手段,主要依靠严格的检疫措施防止该病扩散,所以建立高效,快捷,操作简单的检测技术,为疑似柑桔黄龙病初期的诊断提供准确、可靠的检验检疫技术,是防止此病原菌传播有效手段。现在检验柑橘黄龙病菌的主要方法是PCR,虽然简单快捷、准确灵敏,但是由于柑橘黄龙病原是难培养细菌,在植株组织中分布不均且含量少,病原DNA的获得过程繁琐,再加上当前的大多数黄龙病病原菌分子检测使用的靶标均未经过基因组比较,因而常规PCR有时会出现假阴性或假阳性问题。本实验通过本地BLAST软件,采用单序列比多序列的方法,将目的菌Ca.L.asiaticus的全基因组序列依次与同属的每个其他种的全基因组序列进行比对。选用多序列比对的全基因组比对技术,在全基因组比对的基础上挑选出了合适的核心基因作为分子靶标,设计出了特异性的探针和引物,建立了 Routine PCR和TaqMan探针q-PCR的检测方法,实验结果表明这两种方法均能把目标菌韧皮部杆菌亚洲种Caa.L.asi与 Cau.L.L.amenus、Caaican 及 Ca L.solanacear 3 个种区分开来,最高灵敏度达到6copies/μL,相当于能检测出0.01 fg/μL的DNA,具有良好的特异性和高灵敏度。对实际样品进行检测,能从24份湖南疑似黄龙病叶片样品中检测到3份带菌,有较高的检出率。此外,梨火疫病菌(Erwinniaamylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科植物的火疫病。本研究从梨火疫病菌中鉴定并克隆出两个clpV同源基因,通过同源重组的方法,构建了梨火疫病菌的clpF基因的缺失突变体△clpV-1和△clpV-2,初步分析了△clp V-1和AclpV-2在影响病原菌致病性和梨火疫毒素产量的作用。结果显示,△clpV-2与野生型相比致病性显著降低,梨火疫毒素产量显著下降,而△clpV-1与野生型相比差异不显著。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.66
【图文】：

在探针的３’端标记焚光淬灭基团（ｑｕｅｎｃｈｅｒ，Ｑ），如ＴＡＭＡＲ；探针设计逡逑在两条引物之间且尽量靠近上游引物。当探针完整时，３’端Ｑ基团吸收了仪器不能逡逑检测到的５’端Ｒ基团发射的荧光（见图１）。在扩增过程中，：Ｔ叫酶在延伸阶段遇到逡逑同模板结合的探针时，由于具有３’邋一５’的外切酶活性，会将探针切断，Ｒ逡逑基团分离出来，此时Ｑ基团不能吸收Ｒ基团发射的荧光，仪器就会检测到荧光信号逡逑增强。荧光信号每经过一个循环就有一个指数增长的过程。逡逑非探针类的ｑ－ＰＣＲ是利用只与双链ＤＮＡ结合的荧光染料，在与双链ＤＮＡ结合逡逑后，其荧光会大幅度增强｜５７１。常用的荧光色素有ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｎ５８］，ＰＣＲ反应中加入逡逑荧光染料，染料特异性地结合ＤＮＡ双链后，发射荧光信号，而其他不是双链ＤＮＡ，逡逑ＳＹＢＲ染料不与其结合就没有荧光信号产生，这样就保证了荧光信号的增强与扩增产逡逑物的增加同步。这种方法的优势在于设计的程序通用性好，方便、成本低。不足之处逡逑是由于染料对ＤＮＡ双链分子没有选择性

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本文编号：2745985