大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探

发布时间：2020-07-17 00:12

【摘要】：GRPs(Glycine-rich proteins,富含甘氨酸蛋白),一类结构简单,且富含甘氨酸的高度重复序列组成的一个大家族蛋白,其在植物生长发育、生物防御、非生物胁迫响应等过程中起着重要作用。课题组前期发现一个在pol型细胞质雄性不育和可育植株花蕾中存在表达差异的基因BrGRP1,且在不育花蕾中表达量较高。本试验主要通过cDNA文库构建和筛选、BrGRP1过表达载体构建及遗传转化、转基因植株抗逆性鉴定等研究,初步揭示该基因的生物学功能。主要研究结果如下:(1)以大白菜不育系16C14花蕾为试验材料,采用SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术合成 cDNA,利用 DSN(duplex-specific nuclease)对所得cDNA进行均一化处理,之后与pDONRTM/Zeo载体重组并转化DH10B大肠杆菌菌株,构建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文库。经检测,文库滴度为3.2×106 cfu/mL,库容量约为1.28×10 cfu,重组率97%,插入片段平均大小1.2kb左右。随机挑选100个阳性菌斑进行测序,冗余度仅为3.7%。(2)以文库质粒为模板,利用特异引物GRP-F/R成功克隆到BrGRP1基因cDNA序列。序列分析表明BrGRP1基因完整的ORF(Open Reading Frame,开放阅读框)为804 bp,编码267个氨基酸,分子量为29.7 kDa,等电点为7.3;其编码的BrGRP1蛋白为非跨膜蛋白,也不是分泌蛋白。与白菜基因组预测基因Bra004066序列相似性为93%,拟南芥At1G6787 基因的相似性为65%。(3)利用无缝克隆技术成功构建过表达载体Cam35S-BrGRP1,进一步进行拟南芥遗传转化。通过抗生素抗性筛选和PCR鉴定共获得7个拟南芥转基因纯系,从中随机选取了三个转基因T3代纯系(GRP1,GRP4和GRP5)进行后续试验。与野生型相比,转基因拟南芥在表型上没有发生变化;qRT-PCR分析表明BrGRP1在转基因拟南芥中高效表达。逆境响应研究表明:0.3μmmol/LABA、100 mmol/LNaCl处理可抑制转基因拟南芥种子萌发和幼苗生长。以上结果表明该BrGRP1基因可能参与ABA信号转导过程及NaCl胁迫响应过程。
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S634.1
【图文】：

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２．３．１总ＲＮＡ提取及质量检测逡逑以／？0／型大白菜雄性不育系１６Ｃ１４不育花蕾为材料，提取总ＲＮＡ，经电泳检测，逡逑有２８Ｓ和１８Ｓ两条带，且条带完整，没有弥散，亮度之比约为２：１邋（图２－１）；同时用核酸逡逑仪测定ＯＤ２６０／２８０为２．０３和２．０５，说明所提取的总ＲＮＡ的质量较好，符合文库构建的要逡逑求。逡逑＾—邋２ＳＳ邋ｒＲＮ＇Ａ逡逑＾ＩＳＳ逡逑图２－１大白菜雄性不育系花蕾总ＲＮＡ电泳图逡逑１、２均代表总ＲＮＡ，二次重复。逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｇｅｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ＣＭＳ邋ｆｌｏｗｅｒｓ邋ｉｎ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｃａｂｂａｇｅ逡逑１邋ｎ邋２，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑－１２－逡逑

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逦＾＾ａａｌ邋（５５４３）逡逑Ｘｈｏｌ邋（８９０６）ＬＢ邋ＡｐａＵ（６９８８？逡逑图３－１邋Ｃａｍ３５Ｓ－ＢｒＧＲＰ］过表达载体的构建逡逑Ｆｉｇ．３－１邋Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｔ＇Ｃａｍ３５Ｓ－ＢｒＧＲＰｌ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑②转化液的配置逡逑配制１／２邋ＭＳ转化缓冲液，所包含成分及用量具体见表３－８：逡逑表３－８邋１／２邋ＭＳ转化缓冲液体系逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－８邋Ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆ邋１／２邋ＭＳ邋ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ邋ｂｕｆｆｅｒ逡逑成分逦使ＨＪＭ逡逑Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ逦Ａｍｏｕｎｔ逡逑ＭＳ邋干粉逦２．３５ｇ逡逑蔗糖逦５０．０ｇ逡逑６－ＢＡ（ｌｍｇ／ｍＬ）逦１０．０邋｜ｊ．Ｌ逡逑Ｓｉｌｗｅｔｔ－７７逦４００邋｜ｉＬ逡逑乙酰ｒ香酮逦１０（ＨｉＬ逡逑逦蒸馏水定容至逦ＩＬ逦逡逑将检测阳性的农杆菌阳性菌液以１：１２５稀释于２５０邋ｍｌ大瓶培养基中，２８°Ｃ，邋２００邋ｒｐｍ逡逑培养至00６00约为0．８；之后将菌液４１＾，５邋００0１＾１１１离心５邋１１１丨１１，收集菌体；最后，将逡逑菌体重悬浮于新鲜配制的转化缓冲液中，至终浓度0Ｄ６（Ｗ值为０．６－０．８，并用ＮａＯＨ溶逡逑液调ｐＨ至５．８

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