黄瓜G蛋白α亚基GPA1基因耐低温调控机制分析

发布时间：2020-07-17 12:10

【摘要】：黄瓜作为我国设施栽培中的主要蔬菜作物,其在设施生产中遭遇冬季低温是限制其产量的重要因素。植物G蛋白是由三个不同亚基组成的异源三聚体,它在质膜上能够发挥传递信号的功能,参与植物对胁迫的响应。GPA1的特性及相关功能在拟南芥和水稻中均已研究,但是黄瓜中G蛋白α亚基的特性及相关功能,是否能够通过与低温调控有关的蛋白互作共同调控低温胁迫下不依赖于ABA信号通路的分子机制尚缺乏相关研究。针对这一现状,本研究克隆得到了黄瓜中编码G蛋白α亚基的基因CsGPA1,通过亚细胞定位、免疫组织化学定位及检测CsGPA1的表达模式,分析其生物功能,初步探明了其在黄瓜低温胁迫下的生理分子机制,解析了其在黄瓜低温胁迫中的作用,本文的主要研究结果如下:(1)编码G蛋白α亚基的基因在黄瓜中仅有一个CsGPA1,是单拷贝基因。qRT-PCR的试验结果表明,在各器官组织中均能检测到CsGPA1基因的表达,其在根中的表达量相对最高,其次为幼叶,而CsGPA1在其它的器官组织,如成熟叶、茎、雌花、雄花和果实中转录水平均较低。(2)免疫组织化学定位结果表明,CsGPA1蛋白在黄瓜的叶柄、茎和根尖中均有表达。主要存在于茎的内外韧皮部和根尖的分生组织中,尤其是根尖的分生组织表皮细胞中。亚细胞定位结果表明CsGPA1是定位于细胞质膜上的跨膜蛋白。(3)通过测定野生型(WT)、过表达CsGPA1(OE)株系和干扰(RNAi)株系中种子萌发率和幼苗的形态指标得出:黑暗条件下,过表达CsGPA1可以促进黄瓜种子萌发和早期幼苗(下胚轴长度、茎粗、表面积、投影面积、根体积和根长)的生长;反之,干扰CsGPA1则抑制了幼苗的生长。结果表明:黑暗条件下,CsGPA1可能通过促进过表达株系细胞伸长进而促进早期幼苗的生长。进一步测定WT、CsGPA1-OE和RNAi株系幼苗内源激素(水杨酸)的含量,实时荧光定量PCR和外施水杨酸(SA)分析得出,黑暗条件下CsGPA1可能通过调控幼苗内SA合成关键基因CsCBP60g,CsEDS1,CsSID2(子叶中)和CsSR1基因(下胚轴以及根中)的相对表达量影响黄瓜幼苗内源SA的合成。总之,CsGPA1正调节种子萌发,并参与黑暗条件下黄瓜早期幼苗的生长。(4)低温(6℃)处理60h后发现,与野生型相比,CsGPA1-RNAi株系植株叶片出现更加明显的失水及萎蔫表型,说明干扰(RNAi)株系中,低表达水平的CsGPA1能够减弱植株自身对低温的抵抗能力。与野生型相比,低温胁迫下,干扰(RNAi)株系叶片中Cs WCO413PM,CsICE1,CsCBF1,CsCBF3和CsRD-29基因的相对表达量下调,CsHOS1基因的相对表达量上调;并降低了脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白的含量和抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的活性;提高了相对电导率(REC)和丙二醛(MDA)的含量。结果表明:CsGPA1-RNAi株系耐低温能力降低。同时,应用分裂泛素酵母双杂交系统建立黄瓜叶片cDNA表达文库,初步筛选出11个可能与CsGPA1的互作蛋白;并进一步利用GST pull down技术证明CsWCOR413PM和CsGPA1相互作用,可能共同参与低温胁迫的响应。黄瓜G蛋白α亚基(CsGPA1)主要定位于质膜、茎的内外韧皮部和根尖的分生组织中,尤其是根尖的分生组织表皮细胞中;CsGPA1正调节黄瓜种子萌发,并参与黑暗条件下早期幼苗(子叶、下胚轴和根)的生长;CsGPA1参与了黄瓜幼苗低温胁迫的响应;分裂泛素酵母双杂和GST pull down试验证明CsWCOR413PM和CsGPA1存在互作。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S642.2
【图文】：

序列,信号转导途径,蛋白,植物

胞质的扩散作用把这种信号传递到质膜内，调节细胞内相关基因的表达或触发细胞内逡逑一连串的生理生化反应。ＧＴＰ／ＧＤＰ的转化是Ｇ蛋白活性调节的关键（Ｗａｎｇ扣ａ／．，逡逑２００］）。典型Ｇ蛋白介导的信号转导途径如图１－１所示（Ｕｒａｎｏｅ／ｆｌ／．，２０１３）。Ｇ蛋白作逡逑为信号转导途径的分子开关，信号转导途径持续时间的长短取决于Ｇｏｔ亚基处于ＧＴＰ逡逑结合状态的时间长短。ＧＰＣＲ是一类膜蛋白，由３５０－５００个氨基酸组成，其分子量为逡逑４０－５０邋ｋＤａ左右，具有七个跨膜的ａ－螺旋结构域，其Ｎ端的天冬酰胺残基和糖基化的氨逡逑基酸序列位于细胞外，可以将信号从胞外转移至细胞膜中；而磷酸化的Ｃ端氨基酸序逡逑列则位于细胞内。研究结果证明，拟南芥中的ＧＣＲ１参与了细胞分裂素、ＡＢＡ等多种逡逑激素信号途径（Ｐａｎｄｅｙｄａ／．，邋２００４；邋Ｌｉｕ邋ｅ？ａ／．，邋２０１２）。作为Ｇ蛋白信号转导途径中的负逡逑调控因子，Ｇ蛋白信号转导调节蛋白（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ邋ｏｆ邋Ｇ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＲＧＳ），逡逑能够促进ＧＴＰａｓｅ的水解活性

信号识别,冷害,胁迫条件,转导

ｌｕｃｂｃｎ邋ｏｌ邋Ｅｘａｒｔｔｓｔｏｉ＾ｂ＞邋0？ｎｔｓ逡逑Ｉ邋一少Ｔ＾ｒ，）邋－Q\0逡逑图１－２植物在冷害胁迫条件下信号识别和转导的主要过程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｉｎｔｅｒｐｌａｙ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｉｎ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ逡逑ｔｏ邋ｃｏｌｄ邋ｓｔｒｅｓｓ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋（Ｈｕａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２）逡逑７逡逑

结构图,重组质粒,过表达,引物

＿００４１４１３００）邋Ｇ蛋白ａ亚基基因（ＣｓＧｉＭｉ）序逡逑列和所用过表达载体（ｐＢＩ１２１）的序列信息（图２－３）选择合适的酶切位点Ｉ和逡逑＾２＾１，并根据酶切位点设计特异性的扩增引物：逡逑正向扩增引物：Ｆ邋５，－邋ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＡＡ－３，逡逑反向扩增引物：Ｆ邋５，－邋ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＡ－３，逡逑ＲＢ逦Ｎｐｔｎ邋（Ｋａｎ）逦ＣａＭＶ邋３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ逦ＧＰＡ１逦ＮＯＳ－ｔｅｒ邋ＬＢ逡逑ＮＯＳ－ｐｒｏ逦ＮＯＳ－ｔｅｒ逦Ｘｂａ邋Ｉ逦￥ｍａ邋Ｉ逡逑图２－２过表达载体的结构图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑然后使用获得的ｃＤＮＡ单链进行ＰＣＲ扩增，反应体系为：逦逡逑试剂名称逦体积逡逑ｄｄＨ２０逦３３逦＼ｉ＼逡逑ｃＤＮＡ逦１逦｜ｉｌ逡逑ｌＯｘＰＣＲ邋ｂｕｆｆｅｒ逦５逦ｎｌ逡逑ｄＮＴＰｓ邋（２．５邋ｍｍｏｌ）逦４逦ｐｉ逡逑ＣｓＧＰＡｌ－ＯＥ－Ｆ邋（１０｜ｉＭ）逦２．５逦＾１逡逑ＣｓＧＰＡｌ－ＯＥ－Ｒ邋（ｌＯｐＭ）逦２．５逦＾１逡逑Ｔａｑ邋酶（５邋Ｕ／ｐｌ）逦１逦ｐｉ逡逑逦总体积逦５０ｊｉｌ逦逡逑体系配好后混匀

【参考文献】