黄瓜矮化突变体基因克隆及功能分析

发布时间：2020-07-18 06:58

【摘要】：黄瓜拉丁文学名为Cucumis sativus L.(2n=14),属葫芦科甜瓜属,一年生攀援草本植物,是中国各地夏季主要食用蔬菜之一,也是重要的经济蔬菜作物之一。本研究以课题组前期构建的黄瓜EMS诱变突变体库中筛得的矮化突变体Csdw及其野生型为研究材料,通过表型观察、细胞学观察、外源激素处理及内源激素测定等生理学实验对Csdw的表型进行分析,随后对黄瓜矮化表型的遗传特性进行了分析,根据遗传分析结果,采用Mutmap和KASP等技术对黄瓜矮化候选基因进行了鉴定,并利用生物信息学和转基因等手段对黄瓜矮化候选基因的序列、表达量及功能等进行了进一步的分析,主要研究结果如下:(1)黄瓜矮化突变体Csdw表型分析结果表明,矮化突变体Csdw株高为42.4±2.30 cm,野生型植株的株高为150.6±3.20 cm,Csdw的株高显著低于其野生型;Csdw的平均节间长度为2.21±0.25 cm,野生型植株平均节间长度为7.50±0.29 cm,Csdw的平均节间长度显著短于其野生型;然而在节间数量上Csdw与其野生型均为20个左右,无显著性差异,说明Csdw主要是由于平均节间长度的缩短使植株表现为矮化表型。(2)细胞学观察发现,与野生型相比,Csdw主茎纵切面细胞数目从野生型中的125.7±3.50个显著减少为76±3.41个,表明Csdw主茎细胞的分裂过程受到了抑制,从而使细胞数目减少,影响节间长度。(3)不同浓度外源GA_3处理Csdw后使其在株高及平均节间长度上得到了一定的恢复,且400 mg.L~(-1)浓度GA_3处理后Csdw的恢复程度最大。在株高性状上,Csdw对照组的株高为42.4±2.30 cm,400 mg.L~(-1)浓度GA_3处理后Csdw的株高为64.2±4.40 cm,相比于Csdw对照组显著增加了51.4%,然而却没有恢复至野生型状态(150.6±3.20 cm);在平均节间长度上,野生型对照组平均节间长度为7.5±0.29 cm,Csdw对照组的平均节间长度为2.21±0.25 cm,400 mg.L~(-1)浓度GA_3处理后Csdw的平均节间长度为3.24±0.08 cm,相比于Csdw对照组显著增加了46.6%,同样没有完全恢复至野生型状态。在节间数量上,野生型对照组、Csdw对照组及处理组均为20个左右,无显著性差异。内源激素检测结果表明野生型植株体的内源GA_3含量为4.87±0.44ng.g~(-1).FW~(-1),而Csdw的内源GA_3含量显著减少为2.89±0.25 ng.g~(-1).FW~(-1);内源BR、IAA及ZR含量在野生型和Csdw间均表现无差异。此外,不同浓度外源BR和IAA处理后Csdw没有出现任何恢复现象,说明Csdw对外源激素BR和IAA的处理不敏感。综上结果说明Csdw对于GA_3外源激素处理具有一定的敏感性且体内GA_3含量显著低于野生型。(4)遗传分析表明Csdw突变体矮化表型为单基因隐性遗传。利用全基因组重测序技术将黄瓜矮化突变体基因定位在了黄瓜基因组的第3染色体,后续KASP基因分型技术检测结果表明Csa3G872760包含的SNP基因型与F_2单株表型共分离,表明Csa3G872760为调控黄瓜矮化表型的候选基因。膜蛋白预测及进化树分析结果表明Csa3G872760编码CLAVATA1型类受体蛋白激酶,因此将Csa3G872760命名为CsCLAVATA1。CsCLAVATA1在黄瓜野生型植株不同部位中均可表达,且在茎中的表达量显著低于野生型。(5)利用根癌农杆菌介导的花序浸染法将连有CsCLAVATA1目的片段的RNAi载体PTCK303-CsCLAVATA1转化哥伦比亚野生型拟南芥,通过潮霉素抗性筛选及PCR鉴定共获得5个转基因株系。通过比较拟南芥野生型及5个纯合转基因株系的生长势发现,定植后17-38 d,转基因株系的株高均显著高于野生型,而随着时间的推移,转基因株系植株的株高与野生型的株高渐渐趋于一致。通过比较转基因株系与野生型的抽薹时间发现所有转基因株系植株较野生型提前6 d进入抽薹期。不仅如此,野生型中的茎生叶侧枝数为4条左右,5个转基因株系的茎生叶侧枝数量均为6条以上,最多达9条,转基因株系的茎生叶侧枝数量相比于野生型显著增加。此外,扫描电镜观察顶端花序大小结果表明,野生型植株中的顶端花序平均直径为1.5 mm,转基因株系的顶端花序平均直径均为2 mm以上,最大的接近4 mm,因此转基因株系的顶端花序较野生型显著增大。与CsCLAVATA1同源性最高的拟南芥基因(LOC9329593)在转基因株系中的表达量较野生型明显下调了3.13倍以上,说明了干扰载体在拟南芥转基因株系中发挥了抑制同源基因表达的作用。上述研究结果表明CsCLAVATA1参与调节了植物体SAM的生长发育。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S642.2

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