梨高密度遗传连锁图谱构建及果实品质性状的基因定位

发布时间：2020-07-18 07:08

【摘要】：梨(Pyrus spp.)是一种重要的温带水果,因其肉质甜美多汁及其优良的食用、营养、药用和经济价值而闻名于世。近年来,随着人民生活水平和果树产业技术创新水平的提高,梨品质育种日益重要。但梨许多重要的品质性状受到多基因和环境的共同作用影响,对其进行遗传改良很困难,并且梨世代周期较长,遗传背景复杂,使用传统方法育种的效率较低。本研究以‘苹果梨’×‘八月红’的150株F1杂交后代为试材,采用重测序技术开发SNP标记,结合SSR标记,构建梨高密度遗传连锁图谱。同时,根据调查的群体后代单株的果实性状数据,结合已构建的遗传连锁图谱,利用复合区间作图法对相关性状进行定位分析。主要结果如下:1.利用‘苹果梨’和‘八月红’2个亲本及150个F1群体单株为试材,对来源的不同的220对SSR引物进行筛选,得到在亲本间有效扩增的引物比例在56.4%,多态性比例为42.3%,其中符合作图要求的SSR引物占22.3%,共49对。2.利用重测序的方法,在亲本间共检测到3304623个且深度不低于4×的SNP标记,以Bin为作图标记,构建了一张包含17个连锁群,共3116个Bin位点的梨高密度遗传连锁图谱。17个连锁群的总图距为1727.98 cM,平均图距0.55 cM。3.将符合作图要求的49对SSR引物,成功的把其中42对整合到上述Bin图谱中,分别定位到15个连锁群上,使得上述遗传连锁图谱的长度增加了175.65 cM,总图距达到1903.63 cM,连锁群长度范围为64.19 cM(LG15)-187.68 cM(LG3),相邻标记间平均距离0.47 cM-0.83 cM,其中LG13连锁群标记间平均距离最小,包含标记数161个,LG17连锁群标记间平均距离最大,标记数149个。除LG5和LG15连锁群外,每条连锁群上有1-6个SSR标记。4.利用IBM SPSS Statistics 20和Excel 2016对亲本及F1群体的14个果实品质性状进行相关性分析,其中9个性状(单果重、纵径、横径、果形指数、果心大小、果肉硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、果梗长度)在F1群体中呈连续变异,正态或偏正态分布,为数量性状;另5个性状(涩味程度、红色程度、果实形状、萼片状态、耐贮性)没有明显的连续变异,表现为质量性状特点。多个性状间存在显著相关性:果实纵径和横径与单果重、果肉硬度、果梗长度、果实形状等,性状间相互为极显著正相关;果形指数与可溶性固形物含量、果实形状、涩味程度和可滴定酸含量等,性状间相互为极显著正相关;单果重与果心大小、果肉硬度呈极显著负相关;果梗长度与果肉硬度呈极显著负相关。5.利用构建的图谱和性状表型值,对14个果实品质性状进行基因定位分析,并对区域内基因进行功能注释。采用复合区间作图法,共获区间位点28个:5个单果重QTL位点、2个果心大小QTL位点、3个果肉硬度QTL位点、6个果实横径QTL位点、1个果梗长度QTL位点、6个可溶性固形物含量QTL位点、2个可滴定酸含量QTL位点、萼片状态、红色程度和果实形状各1个区间位点,区间内标签276个,共扫描到2266个基因。其中,果实纵径、果形指数、涩味程度和耐贮性未检测到相关区间。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.2
【图文】：

作图群体

和培育后代的成本。 2001 年至 2013 年，利用随机扩增多态性 DNA（RAPD）、限制性片段长度多态性（R段长度多态性（AFLP）、简单重复序列（SSR）等构建的一些梨遗传连锁图谱，仅记位点，数量有限且不利于进行自动检测。随着全基因组测序的发展，SNP 成为遗建和标记辅助育种的首选标记，与 SSR 标记相比，SNP 标记更丰富且可以很容易件检测到。本研究主要以 SNP 标记为主，再辅以部分 SSR 标记，结合二者优势构连锁图谱，作为未来鉴定和解析许多梨重要和复杂遗传性状的基础。材料与方法1 试验材料研究试验材料为 2005 年春播种的，以苹果梨为母本，八月红为父本的杂交后代 21苗。母本‘苹果梨’属于白梨，果肉细脆多汁、清香爽口，果实扁圆形，果皮绿黄点状红晕，晚熟（9 月下旬至 10 月上旬）耐贮品种（可贮至翌年 5 月份）；父本‘八为‘早巴梨’×‘早酥’，果肉酥脆多汁、风味甜、香气浓，果实卵圆形，果皮黄色色，中早熟（8 月中旬）不耐贮红色新品种（常温下贮放 7～10 天）。二者有较大遗传植于中国农业科学院果树所试验基地，行株距为 3.0m×1.0m，常规管理。2010 年部果，2017 年开始调查，最终随机选择 150 个单株为作图群体。

数据格式,基因型,群体

时间约 40 min。（4）上样电泳轻轻拔掉梳子，将玻璃板安装在电泳槽上固定，将 0.5×TBE 溶液（1.5L 左右）加入到泳槽中，用移液器将点样孔中的气泡吹跑，然后接通电源电压调至 180 V，预电泳 30 min（去气泡和散碎凝胶）后，，上样量 1-2μL，Marker 为 PBR322，电泳时间约为 2h 即可停止。取玻板，取凝胶。（5）银染用蒸馏水洗涤凝胶两次（20s 左右），加染色液，摇床轻摇 3-5min，回收染液，蒸馏水冲洗 2 次，然后加显色液，摇床轻摇 2-3min，条带出现即终止显影，回收显色液，蒸馏水快速洗 2 次，拍照保存。2.1.4.3 数据统计分析将初步筛选到的符合‘拟测交’五种等位基因分离类型（np×nn、hk×hk、Im×II、ef×eg、ab×cd的 SSR 引物，在双亲和 150 份杂交单株中进行再次筛选验证。根据 8%非变性聚丙烯酰氨凝胶泳结果，分别观察每对引物在每份材料中的基因分离类型，按照 CP 模型数据记录标准进行整和分析，标准数据格式如下（无扩增条带或条带模糊的记为“-”）：

示意图,电泳条,示意图,连锁群

传标记分为 17 个连锁群，以连锁群为单位，采用 HighMap（Fujisawa et al, 2011）软件分析获得连锁群内 Marker 的线性排列，估算相邻 Marker 间的遗传距离得到高密度 Bin 遗传连锁图谱。2.1.6.2 遗传连锁图谱整合先将非染色体上的 Bin 标签对图谱进行加密，其中非染色体上的标签按照亲本 10x，完整度70%，偏分离 0.01 进行过滤，Bin 标签分为两种类型，一种是已知位于哪条染色体的，不确定方向和位置的，另一种是不知道染色体等信息的，所以先将已知的标签按照染色体进行加密，然后再将未知的标签按照连锁关系进行加密，构建连锁图谱，构建完成后，利用最终的图谱使用ALLMAPS 软件进行挂载。然后利用 joinmap 软件中的 modified LOD 方法计算 SSR 标记和上图Bin 间的 mlod 值，利用两两标记间的 mlod 值将 SSR 标记整合到不同的连锁群上。最后将分群后的结果进行重新排列构图，整合图谱结果，最终得到 SSR+SNP 整合的高密度遗传连锁图谱。2.2 结果与分析2.2.1 梨基因组 DNA 提取结果

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