桃ERFs和PpIAA1协同调控桃成熟软化的分子机制研究

发布时间：2020-07-19 06:26

【摘要】：根据果肉质地的不同将桃分为溶质型(Melting flesh,MF)、不溶质型(Non-melting flesh,NMF)和硬质型(Stony hard,SH)三种类型。溶质型桃果实在成熟过程中生长素和乙烯均发生跃变,果实迅速变软,不耐储运,货架期短;硬质型桃果实在成熟过程中生长素和乙烯释放量都维持在较低的水平,果实成熟后无论是挂树还是采收均不变软。本研究为阐明生长素和乙烯协同调控桃果实成熟的分子机制,以MF和SH两种不同肉质类型桃为实验材料,筛选在两种肉质桃中表达差异显著的生长素信号转导关键响应因子AUX/IAA和乙烯响应因子(Ethylene responsive factor,ERF),并通过Y1H、EMSA、DLR、桃瞬时表达、Y2H、BiFC、pull-down等实验研究AUX/IAA或ERFs调控桃成熟相关基因(PG、ACS、ACO、NCEDs等)表达的分子机制,以及AUX/IAA和ERFs之间的调控关系,进一步明确生长素和乙烯在桃果实成熟过程中的作用,为培育耐储运、货架期长的桃新品种奠定理论基础。1.桃果实成熟相关ERFs筛选利用番茄的ERF蛋白在桃数据库中Blastp ERFs转录因子,结合‘中油桃13’(CN13)和‘中油桃16’(CN16)果实成熟不同时期(S3、S4I、S4II、S4III)的转录组数据,初步筛选到15个在CN13和CN16中的表达水平存在显著差异的ERF转录因子。利用qRT-PCR进一步从15个候选ERFs转录因子中筛选到在MF和SH两种果肉中表达存在显著差异的7个ERF基因基因Prupe.1G037700(PpERF1)、Prupe.5G090800(PpERF2)、Prupe.7G194400(PpERF3)、Prupe.1G390800(PpERF4)、Prupe.5G061800(PpERF5)、Prupe.3G240000(PpERF6)、Prupe.2G289500(PpERF7)。2.PpERF2、PpERF3、PpERF4调控果实成熟相关基因表达通过转录组分析和qPCR验证筛选到与候选ERFs基因和乙烯合成基因表达趋势相似的ABA合成基因PpNCED2、PpNCED3和细胞壁降解相关基因PpPG1。在线预测发现在PpNCED2、PpNCED3、PpPG1启动子上含有ERFs(CCGAC、A/GCCGAC、AA/TTTCAAA)结合元件和生长素响应元件(CCGACA、TGTCTC)。酵母单杂交和EMSA实验结果表明PpERF2通过CCGAC元件直接结合PpNCED2、PpNCED3、PpPG1启动子;PpERF3结合PpNCED2和PpNCED3启动子;PpERF4通过CCGAC、AGCCGCC元件直接结合在PpNCED2、PpNCED3、PpPG1和PpACO1启动子。烟草瞬时表达实验结果表明PpERF2为转录抑制子;PpERF3和PpERF4为转录激活子。3.PpIAA1调控桃果实成熟软化机理研究在桃基因组中鉴定到22个AUX/IAA,22个AUX/IAA基因中的一些基因在?CN13?中的表达水平明显的高于在?CN16?中的表达,其中包括ppa010303(PpIAA1)基因。酵母单杂交和凝胶滞留(EMSA)实验结果表明PpIAA1能通过CCGACA、TGTCTC、TGTG?TGTG元件分别结合在PpNCED2、PpPG1、PpNCED3、PpACS1启动子上。瞬时表达实验结果表明PpIAA1为转录激活子。酵母双杂交、BiFC和pull-down结果表明PpERF4与PpIAA1互作。与野生型番茄相比,转基因株系植株呈现出没有分支、根系数目减少等性状。转基因株系番茄果实成熟早,且采后储藏性降低。以上结果表明1)PpIAA1可直接结合PpACS1、PpNCED2、PpNCED3、PpPG1启动子,并激活基因的表达。2)PpIAA1与PpERF4互作,并能进一步激活PpNCED2、PpNCED3、PpPG1基因的转录活性。3)PpERF4结合并促进PpIAA1的表达。通过PpIAA1和PpERF4之间合作的这3种机制,生长素和乙烯共同调控桃果实成熟和软化。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S662.1
【图文】：

乙烯信号转导

图 1-1 乙烯信号转导(Liu et al 2015)。Fig. 1-1 ethylene signal transduction pathway (Liu et al 2015).1.2.2 生长素与果实成熟研究表明硬质型桃中乙烯合成基因 PpACS1 的表达受到抑制是乙烯合成量低的原因（Tatsuki et al 2006）。最近的研究表明硬质型桃中低浓度的生长素是抑制基因 PpACS1 表达的原因，因喷施外源萘乙酸（NAA），可以显著的提高乙烯合成基因 PpACS1 的表达水平，乙烯产量明显增加，果实变软（Tatsuki et al 2013在植物器官中已经研究了调节生长素动态平衡的多种机制，如生长素代谢载体依赖的细胞内和细胞间生长素运输（Rosquete et al 2012）。长时间以来，生长素被认为是果实成熟的负调控因子，因为在果实成熟期生长素的浓度很低（Nitsch 1952）。果实成熟初期生长素浓度的下降被认为是果实成熟期的必备条件（Given et al 1988，Chen et al 1999，Purgatto et al 2002，B ttcher et al 2010）喷施外源生长素使果实成熟延迟（Cohen 1996，Purgatto et al 2002，Fabbroni et

乙烯合成,成熟过程,基因

Oetiker et al 1997，Nakatsuka et al 1998， Shiu et al 1998）。其中个基因在果实成熟过程中的表达模式不同：LeACS1A、LeACS2、LeACS4LeACS6（Barry et al 2000）。Barry 等（2000）提出了一个模型来解释在番茄成过程中这些基因的不同调控模式（图 1-2）（Serreze et al 2000）。简而言之，在统 1 中，基因 LeACS6 起主要的作用，尽管基因 LeACS1A 在这些组织中也有达。在果实成熟转化期，基因 LeACS1A 和 LeACS4 开始表达并且依赖于转录子 RIN MADS-box 的调控。随着乙烯合成量的增多，基因 LeACS2 随之也开始达，这就形成了系统 2 乙烯合成的自体调控模式。番茄中的 5 个 ACO（LeACO1-5），其中有 3 种酶在果实中的表达模式不同（LeACO1、LeACOLeACO4）（Blume et al 1997，Van-der-Hoeven et al 2002）。基因 LeACO1 和 LeA在系统 1 中持续表达，但是在进入系统 2 时，其表达水平会显著的增加。然而果实成熟过程中基因 LeACO1 和 LeACO4 的表达水平一直很稳定。

序列,乙烯信号转导

EIN3 二聚体可以特异的结合于转录因子 ERF1 启动子的上游的特定序列。EIN3 的两个同源二聚体 EIL1 和 EIL2 同样具有结合转录因子 ERF1 启动子特定序列的能力；在没有乙烯存在的情况下，EIN3/EIL1 二聚体就会被两个 F-box蛋白 EBF1/EBF2 通过泛素化而降解（Solano et al 1998，Guo et al 2003）。在乙烯存在的情况下，通过进入细胞核中的 EIN2 C 端的作用可以降解 EBF1/EBF2 二聚体，并稳定 EIN3/EIL1 二聚体来响应乙烯应答基因（Potuschak et al 2003，An et al2010）。当用空气处理时，CIR1 可以直接结合并磷酸化至少 EIN2-C 端的两个位点Ser645（S645）和 S924（Wen et al 2012，Qiao et al 2012）。而乙烯可以使 CTR1失活，并失去使 EIN2 磷酸化的能力，这种去磷酸化的 EIN2 的 C 端就会断裂并由细胞质转运至细胞核中，EIN2 的 C 端可以通过抑制二聚体 EBF1/EBF2 的泛素化活性来稳定 EIN3/EIL1 二聚体并响应乙烯应答信号（Ju et al 2012）（图 1-3）。

【参考文献】