莲叶片生物碱合成基因的挖掘及功能鉴定

发布时间：2020-07-20 12:06

【摘要】：莲(Nelumbo nucifera)是药食两用的重要经济作物。我国莲资源丰富,栽培面积1000万亩左右。生物碱是莲中最有经济价值的生物活性组分,但我国莲主栽品种叶片中生物碱含量普遍较低,研究莲叶片生物碱合成遗传机理,创制高生物碱含量的莲新品种无疑有助于提高莲附加值,促进我国莲产业可持续健康发展。为此,本研究对不同莲品种叶片生物碱含量差异以及叶片不同发育阶段生物碱积累特征进行了分析;选用生物碱含量差异显著的莲品种‘Luming’和‘WD40’,通过叶片比较转录组学研究,发掘莲叶片中生物合成途径的结构基因及重要调节基因,探讨莲生物碱的合成调控机理,为高生物碱含量莲品种的培育提供理论依据和分子元件。主要结果如下:1.不同品种间莲叶片生物碱组分与含量的特征分析采用高效液相色谱仪(HPLC)技术检测了38份莲品种叶片中的生物碱组分与含量,构建了莲品种叶片生物碱表型数据库。莲叶片主要积累苄基异喹啉生物碱(benzylisoquinoline alkaloids,BIAs),包含5种组分:番荔枝碱(anonaine)、O-去甲基荷叶碱(O-nornuciferine)、莲碱(roemerine)、N-去甲基荷叶碱(N-nornuciferine)和荷叶碱(nuciferine)~([17,22]),其中荷叶碱是多数品种叶片中占据主导地位的生物碱。同时发现不同品种间叶片生物碱含量存在很大差异。对高BIAs的‘Luming’和低BIAs的‘WD40’两个品种的叶片发育过程中生物碱积累动态变化进行分析,发现生物碱含量在叶片生长过程中呈现逐步增加的趋势,但在叶片衰老时出现少量下降。此外,‘Luming’和‘WD40’叶片中两个主要的生物碱BIAs组分荷叶碱和O-去甲基荷叶碱含量差异很大,但番荔枝碱、莲碱和N-去甲基荷叶碱含量差异很小,且这三种生物碱在整个叶片发育过程中浓度都很低。2.莲BIA的生物合成途径及转录调控基因的挖掘与功能分析至今鲜有关于莲BIA生物合成和调控研究的报道。本研究选用‘Luming’和‘WD40’两个栽培品种叶片为试材,通过叶片发育前期两个阶段的比较转录组学等生物信息学分析,发掘了莲BIA合成途径的结构基因,其中两个串联簇生的CYP80基因NnCYP80A和NnCYP80G发生了功能分化,可能分别参与阿朴啡类型苄基异喹啉生物碱(aporphine-type BIAs)和双苄基异喹啉生物碱(bis-BIAs)的合成;同时发掘了5个生物碱合成调节基因,包含三个MYB基因(NnMYB12、NnMYB6和NnMYB113)、一个乙烯响应因子NnRAV1和一个碱性螺旋-环-螺旋基因NnbHLH1。双荧光素酶实验结果表明,这些调节基因对莲生物碱合成结构基因具有很好的激活作用,同时发现NnbHLH1与NnRAV1基因存在相互作用且对NnNCS1基因的启动子具有强烈的激活能力。总之,上述研究揭示了莲BIA生物合成途径及其转录调控机理,这不仅对深入了解植物BIA生物合成具有重要的理论意义,而且能为创制莲高生物碱新材料提供技术支撑。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.32
【图文】：

结构示意图,生物碱,叶芽,活性成分

图 1-1 莲中三种类型生物碱的结构示意图[21]-1 中 a.单苄基异喹啉型生物碱；b.阿朴啡类型生物碱；c.双苄基异喹啉型生物碱。Fig. 1-1 Schematic diagram of the structure of three types of alkaloids in lotus[21] 1-1 a. monobenzylisoquinoline-type; b. aporphine-type; c. bisbenzylisoquinoline-type,( bs).生物碱是莲中最重要的活性成分之一[4]。自 20 世纪 60 年代首次从莲的叶芽组织中分离出生物碱以来，已经有超过了20个生物碱的种类被发现[16-2

生物合成途径,植物,去甲乌药碱,甲基转移酶

图 1-2 植物中 BIA 的共同前体的生物合成途径[47]图 1-2 中部分标注：酪氨酸；L-二羟基苯丙氨酸；酪氨酸/多巴脱羧酶；4-羟基苯乙醛；L-多巴胺；去甲乌药碱合酶；(S)-去甲乌药碱；去甲乌药碱 6-O-甲基转移酶；(S)-乌药碱；(S)-乌药碱 N-甲基转移酶；(S)-N-甲基乌药碱；(S)-N-甲基乌药碱-3'-羟化酶基因；(S)-3'-羟化酶-N-甲基乌药碱；3'-羟基-N-甲基乌药碱 4'-O-甲基转移酶；图中虚线表示未知的反应。Fig. 1-2 Biosynthetic pathway of the common precursor of BIA in plants[47]Fig. 1-2 annotations: L-tyrosine; L-dihydroxyphenylalanine, DOPA; tyrosine/dopadecarboxylase,TYDC; 4-hydroxyphenylacetaldehyde, 4-HPAA; L-dopamine; norcoclaurine synthase, NCS; (S)-norcoclaurine; norcoclaurine 6-O-methyltransferase, 6OMT; (S)-coclaurine; (S)-coclaurine N-methyltransferase, CNMT; (S)-N-methylcoclaurine; (S)-N-methylcoclaurine 3'-hydroxylase,CYP80B; (S)-3'-hydroxy-N-methylcoclaurine; 3 ′ -hydroxy-N-methylcoclaurine 4 ′ -O-methyltransferase, 4′OMT; (S)-reticuline; The dash line indicates unknown reaction.随后，诸如内部碳-碳，碳-氧-苯酚偶联和官能团取代等各种附加反应导致形成了不同类型的 BIAs。迄今为止，在 BIA 的生物合成途径和生物合成的结构多样化的酶方面已经做出了巨大的贡献，如：吗啡（morphine），黄连素（berberine）

示意图,莲叶,生物碱,峰面积

计算总生物碱的含量并以单位 mg/g，鲜重（FW）表示。使用具有单因素方析（ANOVA）方法的 SPSS 软件计算统计学显著性，并且显著性差异定义.05。2 结果与分析2.1 莲叶中的生物碱组分分析与鉴定为了确定莲品种中叶片的生物碱组分含量情况，我们通过高效液相色谱HPLC）测定莲品种中生物碱含量组分情况，在所有莲品种的叶片中，共鉴 5 个峰，峰 1-5 分别表示 N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、番荔枝碱、荷和莲碱五种生物碱类型，保留时间分别为：5.28min，8.46min，9.30min，1in 和 12.85 min；相关 HPLC 液相峰图显示于图 2-1。

【参考文献】